广藿香PcHAD基因克隆及其参与广藿香醇生物合成功能分析

目的 从广藿香Pogostemon cablin中克隆HAD(haloacid dehalogenase)超级家族蛋白水解酶基因PcHAD,验证其编码蛋白与广藿香醇合酶（patchoulol synthase,Pc PTS）蛋白互作,探究其参与调控广藿香醇生物合成的作用。方法 从广藿香转录组数据中,筛选出一条具有完整编码区并且包含HAD-like结构域的HAD基因序列（Pc HAD）,并对该基因进行克隆和生物信息学分析。利用q RT-PCR对Pc HAD的表达模式进行分析。利用酵母双杂交实验进一步验证Pc HAD与广藿香Pc PTS蛋白的互作情况。通过瞬时过表达Pc HAD,分析其对广藿香醇甲羟戊酸合成途径（mevalonatepathway,MVA）相关基因的表达以及对广藿香醇含量的影响。结果 从广藿香中克隆得到HAD-like基因Pc HAD,其开放阅读框为1149 bp,编码蛋白长度为382个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 000,且为不稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位结果表明该蛋白定位于叶绿体。酵母双杂交实验结果表明Pc HAD完整蛋白能与Pc PTS完整蛋白互作,且Pc HADN...     

黄花蒿bHLH转录因子基因家族鉴定及光调控分析

目的:基于黄花蒿全基因组及转录组数据,进行AabHLH基因家族生物信息学分析及在不同光处理下的基因表达分析。方法:基于基因隐马科夫模型(HMM)对AabHLH基因进行鉴定,利用Pfam、GSDS、MEME等在线分析软件对基因结构、分子进化及保守结构域等进行分析。结果:全基因组水平共鉴定出99条黄花蒿AabHLH基因,包含49对复制基因对;基于系统发育树将其分为13个亚族,所有亚族AabHLH蛋白亚细胞定位于细胞核且均为亲水性蛋白,同一亚族基因具有相似的外显子-内含子结构及保守基序。基因表达模式分析发现,AabHLH基因在不同水平上响应蓝光、红光、远红光、白光调控,推测其中6个亚族基因为光照条件下,7个亚族基因为非光照条件下青蒿素合成途径调控基因。结论:在全基因组水平鉴定了AabHLH基因,为深度解析AabHLH基因功能及其对光调控下青蒿素生物合成调控机制提供参考。     

金线莲中调控胚胎发育WRKY转录因子筛选及克隆分析

目的 探究金线莲Anoectochilus roxburghii中WRKY转录因子时空表达模式并筛选调控金线莲胚胎发育的Ar WRKY基因。方法 基于金线莲转录组数据库进行Ar WRKY转录因子筛选,利用软件进行蛋白质结构域预测、序列比对、理化性质预测与进化树构建等分析。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Ar WRKY基因时空表达模式。根据转录组数据Unigenes克隆Ar WRKY的CDS序列。结果 筛选得到金线莲中23条WRKY转录因子,分别命名为Ar WRKY1～Ar WRKY23;q RT-PCR结果表明Ar WRKY5与Ar WRKY20基因在金线莲叶芽期、花芽期及开花期的花中表达量都显著高于根、茎、叶;克隆得到Ar WRKY5的CDS为600 bp,Ar WRKY20的CDS为1149 bp。结论 筛选得到23个Ar WRKY转录因子并成功克隆获得Ar WRKY5与Ar WRKY20的CDS序列,对探究Ar WRKY转录因子调控金线莲生长发育及验证Ar WRKY5与Ar WRKY20基因功能奠定基础。     

转录调控因子在中药次生代谢调控中的研究进展

许多中药的有效成分为植物次生代谢产物,具有重要的药用价值。但次生代谢的产物的量往往很低。转录调控因子可调控多个参与代谢途径基因的表达。采用基因工程的方法调控转录因子,往往可导致植物中该转录因子所控制性状的较大改变,从而提高中药中有效成分的量,具有广阔的应用前景。     

广藿香醇合成酶基因Pc-PTS_1的克隆和生物信息学分析

目的:从广藿香总RNA中克隆广藿香醇合成酶基因(Pc-PTS_1),并对其进行生物信息学分析。方法:利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得广藿香倍半萜合成酶基因Pc-PTS_1的cDNA全长序列,并利用生物信息学软件对该序列进行相似性和同源性分析,预测其编码蛋白的结构和功能。结果:广藿香倍半萜合成酶基因Pc-PTS_1的开放阅读框(ORF)全长1 713 bp,编码570个氨基酸,含有DDXXD保守序列,并与其他倍半萜合成酶基因具有较高相似性。结论:Pc-PTS_1的克隆及其生物信息学分析为其他倍半萜类合成酶基因的发现和研究提供参考,从分子生物学角度阐释其生物学功能,也为进一步研究其生物合成调控机制奠定基础。     

健脾补肾方对辐射损伤小鼠活性氧及AP-1家族转录调控蛋白表达的影响

目的 研究健脾补肾方对辐射损伤模型小鼠活性氧(ROS)及转录调控蛋白AP-1家族主要成员NF-E2、c-jun和c-fos转录因子蛋白表达的影响,探讨其对辐射氧化损伤及造血细胞增殖和凋亡的作用机理.方法 采用6.0Gy X射线照射建立辐射损伤模型小鼠,将造模成功小鼠随机分为模型组、健脾补肾方小剂量组(100％浓度)、健...     

响应ABA的甘草bZIP转录因子的基因表达及调控研究

目的 研究响应脱落酸（ABA）的甘草碱性亮氨酸拉链（GubZIPs）转录因子的基因表达差异,克隆并分析甘草关键酶基因的启动子序列,为解析bZIP转录因子调控甘草活性成分生物合成提供参考。方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析甘草毛状根中GubZIPs转录因子基因在外源ABA处理下的表达模式及在3年生甘草中的空间表达差异;利用TBtools软件从甘草基因组中提取关键酶基因的启动子片段并克隆,利用生物信息学分析启动子上潜在的关键调控元件。结果 甘草GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因在不同的ABA处理条件下表达模式不同,其中GubZIP1和GubZIP33的响应最为显著。分析GubZIPs基因在甘草不同组织的表达差异发现,GubZIP1和GubZIP5在根部高水平表达,GubZIP33和GubZIP56在叶中高水平表达。基于甘草基因组克隆获得甘草生物合成途径中关键酶查耳酮异构酶（CHI）、查耳酮合成酶（CHS）、β-香树脂醇合酶（β-AS）基因的启动子序列,分析结果显示,CHI基因的启动子区域有2个G-box和1个A-box顺式作用元件,CHS基因的启动子区域有2个ABRE和1个G-box顺式作用元件,β-AS基因的启动子区域有1个ABRE和1个G-box顺式作用元件。结论 甘草毛状根中GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因对ABA均有显著响应,采用50 mg·L^–1的ABA处理3 h是研究甘草中ABA相关通路较为适宜的方案。此外甘草的关键酶基因启动子上存在可与bZIP转录因子结合和响应ABA等激素的顺式作用元件;研究结果可为深入解析响应ABA的bZIP转录因子调控甘草活性成分生物合成的分子机制提供参考。     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析

WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框 (ORF) 1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子。酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因 (His3,Ade2) 的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子。半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达。qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯 (MeJA) 和壳聚糖 (chitosan) 诱导,分别在2 h和1 h,表达量达到最高峰。研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础。     

广藿香对营养性肥胖大鼠的降脂作用的转录组学研究

目的:利用RNA-Seq技术对广藿香干预的营养性肥胖大鼠的肝脏进行转录组学测序,探究其降脂效果与作用机制。方法:24只雄性SD大鼠,按体重随机分成8只正常对照组、16只高脂饲料诱导组。饲养4周营养性肥胖造模成功后,将高脂饲料诱导组按体重和血清甘油三酯(TG)含量随机平均分为模型组、广藿香3 g/kg组。给药4周后,取血清检测TG、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量,取动物肝脏进行RNA提取,测序筛选差异基因,进行GO功能注释和KEGG富集分析,并进行Western Blot验证。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠体重、Lee's指数、TG、CHOL、LDL-C含量显著升高,与模型对照组比较,广藿香3 g/kg组大鼠体重有降低趋势,大鼠血清中的TG含量明显下降。测序及KEGG富集分析显示,与模型对照组相比,广藿香3 g/kg组胰岛素信号通路中Fasn、Ppp1r3b基因显著下调,Socs2基因明显上调,Western Blot检测的蛋白表达与转录组基因表达分析结果相一致。结论:芳香化湿药物广藿香对营养性肥胖大鼠的降脂作用,可能是调控胰岛素信号通路中Fasn、Socs2、Ppp1r3b相关基因和蛋白表达来发挥作用。     

参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究

目的揭示参环毛蚓MT-2基因的转录调控机制,为今后采用基因工程技术改良参环毛蚓重金属富集性状奠定基础。方法根据已知的MT-2c DNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增参环毛蚓MT-2基因的编码区基因组序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。结果经PCR扩增、测序后获得2 826 bp MT-2基因编码区序列,将该序列与已知MT-2 c DNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1 534 bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个特异响应重金属参与调控MT-2表达的MRE元件。结论参环毛蚓的MT-2基因能被重金属诱导表达,MT-2基因转录水平的金属调控是通过MT-2基因启动子区的金属调控元件MRE来实现的。     

吴茱萸汤及其各组分对TPH2启动子活性的影响

目的:利用分子生物技术构建色氨酸羟化酶(TPH2)启动子调控红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)转基因细胞,以筛选吴茱萸汤及其各组成药物对TPH2启动子的调控活性,探讨其治疗偏头痛可能的分子靶点.方法:构建TPH2启动子调控红色荧光蛋白表达的转基因细胞系,观察统计不同给药组中细胞荧光强度的变化及发光细胞数量的变化.结果:通过荧光细胞计数发现吴茱萸汤、吴茱萸、生姜、大枣水提物不同透析部分在不同浓度上对TPH2启动子转录活性具有不同的调控作用.结论:吴茱萸汤治疗偏头痛的可能分子靶点与激活TPH2表达有关.TPH2启动子调控红色荧光蛋白表达细胞模型可用于对以此为靶点的药物筛选和活性评价.     

广藿香青枯病菌的分离培养及致病性测定

目的分离广藿香青枯病病原菌Ralstonia solanacearum,了解其细菌学性状,并进行致病性测定,为广藿香青枯病的防治提供依据。方法在TZC培养基[蛋白胨10.0 g、酸水解酪蛋白1.0 g、TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)0.05 g、葡萄糖10.0 g、H2O 1 L,pH 6.8～7.0]上划线分离培养广藿香青枯菌;通过3糖3醇试验对各菌株的生化型进行划分;采用伤根浸泡接种法对分离所得菌株进行致病性测定。结果经分离纯化,得到在细菌学性状上有明显差异的7个青枯菌菌株。其中HX5、HX7为生化型I;HX1、HX6为生化型II;HX2、HX4为生化型III;HX3为生化型V。致病性试验表明,大部分青枯菌菌株表现较强的致病性,其中以菌株HX4和HX5致病力强且致死率高。结论广藿香青枯病菌存在多个生理小种,在菌体形态、生化分型和致病性等方面均有一定的差异。     

广藿香生药、化学及药理学的研究进展

广藿香P og ostem on cablin别名刺蕊草、藿香,以干燥地上部分入药,是著名“南药”之一,为临床上常用的芳香化湿药,具有芳香化湿、和中止呕、发表解暑的功能。近年来对广藿香进行了包括品种鉴定、化学成分、药理作用和组织培养等方面的广泛研究,阐明了广藿香的性状和显微特征,分析了影响其化学成分和量的各种因素,并对广藿香调节胃肠道功能和抗菌的药理作用进行了重点归纳。这些研究均为进一步探讨广藿香的品质评价标准、揭示其化学成分与药理作用的相关性提供了理论基础。     

阳春砂萜类合酶AvTPS1启动子的克隆及其活性分析

目的获得药用植物阳春砂Amomumvillousm的萜类合酶基因Av TPS1的启动子并进行活性分析。方法从阳春砂叶片基因组DNA(g DNA)中克隆获得Av TPS1基因,再通过FPNI-PCR的方法从阳春砂叶片g DNA中克隆Av TPS1的启动子并进行序列分析,构建由该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的重组表达载体p CAM-Av TPS1p,利用农杆菌介导法注射侵染烟草Nicotianabenthamiana叶片进行瞬时表达来验证Av TPS1启动子的活性。结果获得Av TPS1的g DNA序列长度为2444 bp,经过序列比对发现Av TPS1含有7个外显子和6个内含子;通过FPNI-PCR成功获得568bp的Av TPS1启动子序列,其含有10种顺式作用元件,包括保守元件TATA-box和CAAT-box,以及可被转录因子MYC结合的G-box等;通过GUS染色发现Av TPS1启动子启动了GUS基因的表达,使转基因烟草叶片呈现蓝色。结论 Av TPS1启动子被成功克隆,且通过实验验证其具有启动基因表达的功能,为进一步研究Av TPS1在萜类合成途径的功能及其受转录因子调节的机制奠定了基础。     

黑果枸杞R1-MYB转录因子基因的克隆及表达分析

目的对可能参与花青素代谢调控的黑果枸杞R1-MYB转录因子基因进行克隆、生物信息学分析和不同品种、同一品种不同器官及盐胁迫条件下差异表达分析。方法通过同源基因克隆和RACE方法得到黑果枸杞R1-MYB转录因子编码区全长,通过转录组数据获得宁夏枸杞同源基因序列。通过Prot、Param、Smart、PSORT和SOPMA进行生物信息学分析,通过MEGA 5.0构建NJ系统进化树。同时采用Real-time PCR的方法进行基因表达分析。结果获得黑果枸杞Lr MYB1R1(KY568981)及宁夏枸杞Lb MYB1R1(KY568982)基因全长c DNA,c DNA编码区全长1 496 bp,编码区为927 bp,编码产物包含308个氨基酸,编码蛋白相对分子质量分别为33 400和33 490,理论等电点分别为7.80和7.78,属于R1-MYB转录因子,经预测其编码蛋白位于细胞核中;Lr MYB1R1和Lb MYB1R1与茄科植物番茄、马铃薯、烟草中的MYB1R1-like蛋白具有高度相似性。Lr MYB1R1的表达表现出器官和发育阶段中差异性,具有品种特异性,Lr MYB1R1的表达受盐胁迫抑制。结论丰富了对R1-MYB转录因子的研究,为接下来的基因功能研究及利用基因工程手段提高黑果枸杞中花青素含量奠定基础。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

虎杖MYB转录因子PcMYB1的表达特性和功能研究

目的对虎杖中1个新的R2R3-MYB转录因子基因PcMYB1进行转录活性鉴定和表达特性分析,并在转基因拟南芥中进行功能研究。方法利用酵母单杂交实验分析PcMYB1的转录活性;荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测虎杖中PcMYB1的表达模式;利用Wiesner染色和溴乙酰法检测PcMYB1转基因拟南芥中的木质素含量;RT-PCR技术分析PcMYB1转基因拟南芥木质素合成相关基因的表达。结果酵母单杂实验结果表明,PcMYB1具有转录抑制活性;RT-PCR结果显示PcMYB1在虎杖根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,并且紫外照射处理可诱导叶片中PcMYB1的表达;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥的株高降低了24.07%,木质部的细胞染色程度浅,转基因拟南芥木质素含量降低了14.81%,参与木质素合成的AtC4H、AtC3H、AtF5H、AtCOMT、AtCAD基因表达下调。结论 PcMYB1具有转录抑制活性,对植物木质素合成具有负调控作用。