丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在小鼠睾丸组织中的表达及意义

【摘要】 目的 通过研究丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2（serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2） 基因mRNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的表达特征，探讨该基因在精子发生过程中的作用及意义。 方法 分别采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹杂交（Western blotting）分析该基因mRNA及蛋白产物在小鼠多种组织中的表达；利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR）分析SRPK2 mRNA在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的差异表达；应用免疫组织化学染色和间接免疫荧光技术观察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位和生精细胞内的亚细胞定位。 结果 半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睾丸组织中均大量表达；实时定量PCR分析发现SRPK2 mRNA在5周及8周龄雄性小鼠睾丸组织中显著表达，具有明显的阶段特异性表达特征。免疫组织化学染色结果表明SRPK2蛋白阳性着色主要位于曲精小管中的长形精子细胞核；间接免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位于长形精子细胞核表面。 结论 SRPK2基因在小鼠睾丸组织中大量表达，并且具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞核定位，极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程，其作用机制值得进一步深入研究。     

Ddx3基因在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达

目的:观察小鼠睾丸初次生精过程中的发育特点;检测Ddx3基因与蛋白在小鼠睾丸生精过程中的表达模式;探讨Ddx3基因对小鼠睾丸生精的影响。方法:采用HE染色与PAS染色的方法观察不同日龄小鼠睾丸组织的石蜡切片;用荧光实时定量PCR的方法检测Ddx3 mRNA在小鼠睾丸精子发生过程中的表达;采用免疫组织化学和Western blot方法检测DDX3蛋白在小鼠睾丸初次生精过程中的表达特点和细胞内定位。结果:HE染色结果显示4、13、21、35、42和60日龄是小鼠睾丸发生初次生精过程的特定阶段;荧光实时定量PCR结果显示Ddx3 mRNA在4日龄以后小鼠睾丸组织中均有表达,于35日龄开始明显增高,随后表达水平保持稳定;Western blot显示DDX3蛋白在35、42和60日龄小鼠睾丸生精小管中出现特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示DDX3蛋白主要在初级精母细胞和精子细胞的细胞质和细胞核中表达。结论:DDX3蛋白在小鼠初次精子发生过程中呈现特异性表达,提示Ddx3基因可能在精母细胞与精子细胞的发育中发挥作用。     

Boule基因在小鼠精子发生过程中的动态表达

目的:研究雄性不育相关基因Boule在小鼠出生后首个精子发生波中的动态表达,探讨Boule在精子发生过程中的调控作用。方法:运用免疫印迹法分析BOULE蛋白在多组织中的表达情况。运用实时荧光定量、免疫组织化学和免疫荧光技术检测Boule m RNA和BOULE蛋白在雄性小鼠出生后首个精子发生波各个时间点中的表达。结果:1免疫印迹法显示BOULE蛋白在睾丸中特异性高表达,在出生后16 d睾丸可被检测到,并在随后的发育中睾丸和成年睾丸持续表达;2实时荧光定量方法证实Boule m RNA在雄鼠出生后14 d睾丸中可被检测到,20 d呈现表达高峰;3免疫组织化学显示在精母细胞及圆形精子细胞胞质中存在BOULE蛋白阳性信号。结论:Boule在精子发生过程中的表达是在发育水平精密调控的,在粗线期精母细胞和圆形精子细胞阶段的特异表达提示Boule可能在精母细胞进程和圆形精子细胞中发挥作用。     

PDCD4在雄鼠生殖细胞中的表达研究

目的：验证程序性细胞死亡因子4 (programmed cell death 4,PDCD4)在小鼠雄性生殖细胞中的表达。方法：RT-PCR检测PDCD4在不同周龄小鼠睾丸的基因表达情况;Western blot法检测PDCD4在不同周龄小鼠睾丸中蛋白表达水平;免疫荧光法检测PDCD4在雄性生殖嵴以及在不同周龄小鼠睾丸的定位情况。结果：RT-PCR和Western blot结果均显示PDCD4在0周龄小鼠睾丸中开始有表达,并持续表达至成年;免疫荧光显示PDCD4在胚胎期雄性小鼠生殖细胞中也有表达;在出生后0周和1周龄小鼠睾丸中,PDCD4特异表达于精原细胞;在2周龄小鼠睾丸中,PDCD4分布于精原细胞和精母细胞;而在3、4和5周龄小鼠睾丸组织中,PDCD4主要分布于精原细胞、精母细胞与圆形精子细胞。结论：PDCD4分布于胚胎期和出生后各阶段生精细胞,这为进一步研究PDCD4在精子发生中的作用打下基础。     

Plac8l1在小鼠精子发生过程中的表达特征研究

目的：探讨Plac8l1（placenta-specific 8 like 1）基因在小鼠睾丸组织的表达特征,及其与精子发生的相关性。方法：经生物信息学方法初步筛选到一个睾丸特异性表达候选基因Plac8l1,并推测其可能与小鼠精子发生相关;采用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR对Plac8l1表达的时空特异进行了研究;应用原位杂交技术对Plac8l1 mRNA在成年小鼠睾丸中的细胞类群表达特征进行初步研究;通过构建过表达PLAC8L1-EGFP重组蛋白质粒及生物信息学分析进行亚细胞定位研究与功能预测。结果：①Plac8l1是1个睾丸特异性转录基因。②在成年小鼠,Plac8l1只在睾丸和附睾组织发生特异性转录,而且睾丸中的表达水平明显高于附睾[睾丸vs. 附睾=[（1.000±0.000） vs. （0.036±0.018）,P=0.000]。③随着小鼠精子发生的起始,睾丸中Plac8l1转录水平逐渐升高（P=0.000）。④mRNA原位杂交结果显示Plac8l1 mRNA主要定位在成年小鼠睾丸中的间质细胞和精母细胞。⑤经生物信息学分析,PLAC8L1也有着一个类似于PLAC8的功能域,过表达重组蛋白显示PLAC8L1在细胞膜上聚集。结论：Plac8l1是1个睾丸特异性基因,可能与精子发生过程中的精母细胞分化相关;PLAC8L1具有1个富含半胱氨酸的PLAC8结构域,这一结构域可能介导了PLAC8L1在细胞膜上聚集并与其他蛋白相互作用,并可能在精母细胞分化中发挥重要作用。     

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中甲基化的研究

目的:检测Oct-4在小鼠精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)诱导分化前后的表达及甲基化状态。方法:体外分离培养小鼠SSCs,用干细胞因子(stem cell factor,SCF)诱导其向精母细胞方向分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR,检测Oct-4在小鼠SSCs诱导分化前后的表达;运用甲基化特异性PCR检测Oct-4在小鼠SSCs诱导分化前和分化后2d的甲基化状态。结果:间接免疫荧光染色和RT-PCR显示,Oct-4在小鼠SSCs诱导前有表达,诱导2d后表达下降;甲基化特异性PCR显示,Oct-4在小鼠SSCs诱导前未发生甲基化改变,诱导2d后检测到其甲基化状态。结论:Oct-4基因在小鼠SSCs定向诱导分化中的表达下调可能是其启动子区CpG岛甲基化的缘故。     

小鼠实验性睾丸炎期间生精细胞凋亡的观察

目的:观察睾丸炎期间生精细胞凋亡的情况.方法:Giemsa染色、TUNEL及流式细胞术测定.结果:经Giemsa染色可见一些生精细胞及巨大核细胞的细胞核染色致密,形状不规则.流式细胞仪测定发现正常小鼠睾丸内亚单倍体很少,模型小鼠睾丸内亚单倍体增多.TUNEL阳性细胞在模型小鼠睾丸内增多,主要为精原细胞、精母细胞及管腔中的巨大核细胞.结论:正常小鼠睾丸中可见少量凋亡的生精细胞.睾丸炎期间凋亡的生精细胞增多.此时出现的一些巨大核细胞也是凋亡中的细胞.     

睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响

目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.     

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中的表达

目的：检测Oct-4在小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,mSSCs）体外诱导分化中的表达。方法：①体外培养mSSCs;②用干细胞因子（SCF,stem cell factor）对mSSCs进行精母细胞方向诱导分化;③通过形态学观察和c-kit,GCNF间接免疫荧光染色鉴定mSSCs是否发生分化;④通过间接免疫荧光染色和RT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达情况。结果：①形态学观察mSSCs细胞核较大,细胞质少,SCF诱导培养后,随着培养时间的延长,细胞克隆逐渐增长缓慢,并出现衰退、凋亡的细胞;②c-kit,GCNF间接免疫荧光染色结果显示,mSSCs经SCF诱导后发生分化;③Oct-4间接免疫荧光染色和RT-PCR结果显示,Oct-4在mSSCs诱导前表达水平最高,诱导2天后下降,5天后几乎不表达。结论：Oct-4是mSSCs未发生分化的标志。     

Lrg1基因敲除损伤小鼠睾丸睾酮产生与生精功能

目的 利用富亮氨酸α-2-糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,Lrg1基因敲除小鼠模型,对Lrg1在睾丸中的生物学功能进行研究.方法 通过Crispr/cas9技术制备Lrg1基因敲除小鼠.6只4月龄Lrg1基因敲除雄性小鼠与6只4月龄野生型雄性小鼠分别作为实验组与对照组,HE染色方法观察两组小鼠睾丸形态变化,采用ELISA方法测定小鼠促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)与睾酮水平.利用高通量测序方法分析睾丸组织基因转录谱表达变化.结果 LRG1表达于睾丸精原细胞与精母细胞.免疫荧光与Western blot实验结果表明LRG1蛋白在敲除小鼠睾丸中表达缺失.Lrg1敲除影响睾丸发育:生精小管直径降低[(196.22±27.88) μm vs(183.67±26.32) μm,P＜0.05],退化生精细胞增多[(26.17 +±5.03)vs(196.00 ±40.34),P＜0.01],平均每生精小管圆形精子数量减少[(76.00±12.45)vs(60.00±11.40),P＜0.01].血清睾酮水平下降[(2.90±0.92) ng/mL vs(1.90±0.29) ng/mL,P＜0.05].附睾精子数量减少,活力降低.生物信息学分析显示Lrg1敲除导致差异表达的基因集中于有丝分裂、减数分裂、染色体分离及代谢程序.具有转录调控作用的48个C2H2锌指蛋白家族成员和17个miRNA在Lrg1敲除睾丸中表达异常,提示睾丸转录调节网络失调.结论 Lrg1基因在小鼠睾丸中参与生精功能与睾酮合成.     

Effects of Saikokaryukotsuboreito on Spermatogenesis and Fertility in Aging Male Mice

Background:

Aspermia caused by exogenous testosterone limit its usage in late-onset hypogonadism (LOH) patients desiring fertility. Saikokaryukotsuboreito (SKRBT) is reported to improve serum testosterone and relieve LOH-related symptoms. However, it is unclear whether SKRBT affects fertility. We aimed to examine the effects of SKRBT on spermatogenesis and fertility in aging male mice.

Methods:

Thirty aging male mice were randomly assigned to three groups. Mice were orally administered with phosphate-buffer solution or SKRBT (300 mg/kg, daily) or received testosterone by subcutaneous injections (10 mg/kg, every 3 days). Thirty days later, each male mouse was mated with two female mice. All animals were sacrificed at the end of 90 days. Intratesticular testosterone (ITT) levels, quality of sperm, expression of synaptonemal complex protein 3 (SYCP3), and fertility were assayed.

Results:

In the SKRBT-treated group, ITT, quality of sperm, and expression of SYCP3 were all improved compared with the control group (ITT: 85.50 ± 12.31 ng/g vs. 74.10 ± 11.45 ng/g, P = 0.027; sperm number: [14.94 ± 4.63] × 10⁶ cells/ml vs. [8.79 ± 4.38] × 10⁶ cells/ml, P = 0.002; sperm motility: 43.16 ± 9.93% vs. 33.51 ± 6.98%, P = 0.015; the number of SYCP3-positive cells/tubule: 77.50 ± 11.01 ng/ml vs. 49.30 ± 8.73 ng/ml, P < 0.001; the expression of SYCP3 protein: 1.23 ± 0.09 vs. 0.84 ± 0.10, P < 0.001), but fertility was not significantly changed (P > 0.05, respectively). In the testosterone-treated group, ITT, quality of sperm, and expression of SYCP3 were markedly lower than the control group (ITT: 59.00 ± 8.67, P = 0.005; sperm number: [4.34 ± 2.45] × 10⁶ cells/ml, P = 0.018; sperm motility: 19.53 ± 7.69%, P = 0.001; the number of SYCP3-positive cells/tubule: 30.00 ± 11.28, P < 0.001; the percentage of SYCP3-positive tubules/section 71.98 ± 8.88%, P = 0.001; the expression of SYCP3 protein: 0.71 ± 0.09, P < 0.001), and fertility was also suppressed (P < 0.05, respectively).

Conclusion:

SKRBT had no adverse effect on fertility potential in aging male mice.     

Expression profile of a novel germ cell-specific gene,TSCPA, in mice and human

In order to identify novel genes involved in spermatogenesis, testis cDNA samples from Balb/C mice of different postnatal days were hybridized with the whole mouse genome Affymetrix chip to screen the testis-specific genes. The characteristics of the selected genes were analyzed by RT-PCR as well as other bioinformatic tools. A novel differentially expressed testis-specific gene （GenBank Accession No： NM_029042） in the developmental stages of testes was identified, and named TSCPA. Cellular mapping prediction of TSCPA indicated that its protein was probably expressed in nuclei, and one putative domain （aa 332 377） was anchoring domain of cAMP-dependent type Ⅱ PK. The result of subcellular localization of GFP-TSCPA fusion protein in Cos-7 cells showed that TSCPA protein was expressed in nuclei. RT-PCR analysis revealed that TSCPA was expressed specifically in mouse and human testis. TSCPA gene was expressed weakly in 21-day-old mouse testis and the expression was increased gradually from 38th day to 6th month of mouse testes. No expression of hTSCPA was found in cryptorchidism and Sertoli-cell-only syndrome patients. It was concluded that the expression profile of TSCPA in human and mice indicated that TSCPA might play an important role in spermatogenesis.     

原位杂交法检测不同发育阶段小鼠睾丸中TERT mRNA的表达

本实验应用原位杂交方法检测出生后 10d～ 90d雄性小鼠睾丸中TERTmRNA表达及定位。原位杂交方法 (Insituhybridization)结果显示 :① 10d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮中尚无TERTmRNA阳性表达 ;② 2 0d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮可见TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞 ;③ 30d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮也可见TERTmRNA阳性表达 ,初级精母细胞表现强阳性表达 ;④ 6 0d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮可见明显TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞及精子细胞 ;⑤ 90d雄性小鼠睾丸的曲细精管上皮有较强烈的TERTmRNA阳性表达 ,阳性表达位于初级精母细胞。此结果提示我们 :端粒酶在精子发生过程中存在动态变化 ,端粒酶的表达与精子发生存在密切关系。     

半翼基因蛋白在实验鼠卵细胞联会复合体中的表达位置

目的探讨半翼基因（wings apart—like,Wapl）蛋白在实验鼠粗线期的卵细胞中联会复合体（synaptonemal complex,SC）的表达位置。方法从受孕18．5d胎鼠的卵巢中分离出处于粗线期的卵细胞,然后用抗-联合复合体蛋白2（anti-synaptonemal complex protein2,SYCP2）和抗-Wapl蛋白进行双免疫染色。结果SYCP2和Wapl在所检查粗线期的卵细胞位置重叠。结论Wapl可能是粗线期卵细胞SC的一部分。     

p38丝裂原活化蛋白激酶在雄性小鼠生殖细胞株中的表达

目的 检测p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)在雄性小鼠生殖细胞株TM4、GC-1spg、GC-2spd(ts)中的表达,为深入研究p38 MAPK基因在雄性小鼠精子发生中的作用机制奠定理论基础.方法 应用逆转录-多聚合酶链反应(RT-PCR)检测雄性小鼠生殖细胞株TM4、GC-1spg、GC-2spd(ts)中p38 MAPK基因的表达.结果 p38 MAPK基因在TM4、GC-1spg、GC-2spd(ts)细胞株中均为阳性表达.结论 p38 MAPK基因的表达在雄性小鼠精子发生中可能发挥重要作用.     

Spatio-Temporal Expression Patterns of Aurora Kinases A,B in Mouse Zygotes during the First Mitosis

Objective To investigate the expression and localization of Aurora kinase A (AURKA) and Aurora kinase B (AURKB) in mouse zygotes during the process of the first mitosis. Methods Quantitative real-time RT-PCR and Western blotting were performed to analyze the expression of AURKA and AURKB. The subcellular location of AURKA and AURKB was studied by confocal microscopy. Results AURKA and AURKB were increasingly expressed from phase G1 and peaked at phase M. After the entrance into mitosis AURKB became the predominant form both in mRNA and protein levels. The proteins of AURKA and AURKB both distributed in the cytoplasm and were associated with nucleus during the first mitosis of mouse zygotes, with some details in different. Conclusion The expression and localization of Aurora kinases A and B was in a cell-cycle regulated manner during the process of the cleavage of mouse zygotes. This discovery will aid in future investigations on their specific roles and molecular mechanisms in the regulation of mammalian early embryonic development.     

APP/PS1转基因小鼠大脑内锌转运蛋白3的表达

目的研究锌转运蛋白3(ZnT-3)在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质及海马内的分布和表达变化。方法应用免疫组织化学技术检测ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠脑内的分布,并应用Western blot方法分析ZnT-3在大脑皮质及海马的表达水平。结果ZnT-3主要分布于APP/PS1转基因小鼠脑内的老年斑中,且主要定位于老年斑周围变性的神经元及其突起内;ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马的表达均明显高于野生型小鼠。结论ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑内的高表达以及在老年斑内的定位,提示ZnT-3可能在老年斑内锌离子的聚集过程中起着重要的调节作用,进而参与了APP/PS1转基因小鼠大脑内Aβ老年斑的形成。