白念珠菌菌丝相和酵母相ERG11基因部分序列差异性的探讨

目的 研究白念珠菌菌丝相和酵母相细胞ERG11基因碱基序列上的差异，探讨两相细胞之间的差异性。方法 分别抽提从同—HIV阳性患者体内分离到的7株对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌菌丝相和酵母相的DNA，此系白念珠菌经染色体水平及DNA水平证实来源于同一亲本。根据ERG11编码序列设计一对引物，对ERG11的近3’端的310bp的碱基序列进行PCR扩增，引物序列为：上游引物5’-GGGAAAGTTTCTAAAGGGG-3’：下游引物5’-TATGrITAATCCAACTAAGTAA-3’。经PCR产物直接测序比较两相细胞ERG11基因碱基序列上的差异。结果 1株氟康唑剂量依赖性敏感和2株氟康唑耐药白念珠菌的菌丝相与酵母相细胞间均出现ERG11基因1547位点、1587位点和1617位点的不一致。结论 白念珠菌的菌丝相和酵母相ERG11基因的部分序列存在差异。     

特比萘芬对白念珠菌酵母相和菌丝相抗菌活性的比较

特比萘芬（ terbinafine）属丙烯胺类抗真菌药,可特异性地阻断真菌细胞膜角鲨烯环氧化酶的活性,从而造成角鲨烯在膜内的堆积和麦角固醇的耗竭。此双重作用的结果产生了杀菌效应。但并非所有的病原真菌均对该药高度敏感,有报道除对近平滑念珠菌外,特比萘芬对其它致病念珠菌均为抑菌效应 [1]。众所周知,作为致病念珠菌中的优势菌种, 白念珠菌的形态有双 相性,其致病状态主要呈菌丝相 [2],这是该菌的重要致病力之一。明确这两相对抗真菌药物的敏感性有无差异对指导临床治疗有重要意义。本研究在这方面做了初步探讨。 一、 材料和方法 …     

基于PCR-LIS-SSCP的白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-LIS-SSCP图谱的比较,探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提16株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计7对引物,对其进行分段PCR扩增,扩增产物经单链变性后,以非变性聚丙烯酰胺凝胶进行SSCP分析。结果16株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出目的片段,SSCP图谱显示两相细胞的ERG11基因序列存在多位点差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11,基因存在着差异。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较研究

目的 通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较,探讨两相在DNA水平的差异。方法 对5株分离自同一HIV阳性患者的白念珠菌分别进行菌丝相与酵母相培养后,抽提基因组DNA,PCR扩增ERG11基因(包括部分上游和下游非编码区),用下游引物对部分ERG11基因进行测序。结果CA-7菌丝相与酵母相ERG11基因序列存在差异,分别位于第1547,1587和1617位点。结论 白念球菌菌丝相与酵母相在DNA水平存在差异,在进行白念珠菌的病原真菌学研究中菌丝相为适宜的研究对象。     

EFG1和HGC1基因在白念珠菌菌丝相和酵母相的表达差异

目的比较白念珠菌双形态性的两个调控基因,即增强菌丝生长基因(Enhanced Filamentous Growth,EFG1)和菌丝G1细胞周期蛋白基因(hyphal G protein cycle1,HGC1)在菌丝相和酵母相中的表达情况,寻找调控菌丝表达的关键基因。方法分别提取白念珠菌菌丝相和酵母相的RNA,行半定量RT-PCR检测,比较EFG1和HGC1两个基因的RNA表达差异。结果EFG1在菌丝相和酵母相都有表达,差异无显著性意义,而HGC1在菌丝相有表达,在酵母相无表达。结论HGC1为菌丝特异基因。     

念珠菌碱溶性β—葡萄糖水解生成葡萄糖含量的分类鉴定意义

目的：探讨8种医学上重要的念珠菌酵母相胞壁碱溶性β－葡聚糖解生成的D－葡萄糖占菌体干重含量百分率的分类鉴定意义。方法：采用双波长薄层扫描法，测定65株8种念珠菌及8种酿酒酵母的标准菌株上述含量值，并检测46株念珠菌临床分离株，且与标准株结果相比较。结果：实验结果经Tukey法统计处理，可将9种菌分为3个同质性亚群，亚群1：酿酒酵母、克柔、季也蒙、光滑、热带念珠菌（P＝0．065），亚群2：克柔、季也蒙、光滑、热带、近平滑、伪热带、星形念珠菌（P＝0．336），亚群3：白念珠菌（P＝1．000）。此外，酿酒酵母与8种念珠菌经t检验，均有显著性差异。临床分离株与标准标均无显著性差异。结论：该指标能在属水平区分念珠菌和酿酒酵母，可将8种念珠菌分为3个亚群，且重复性较好。因此似能作为一种念珠菌分类鉴定研究的化学分类法指标。     

念珠菌碱溶性β-葡聚糖水解生成葡萄糖含量的分类鉴定意义

目的 :　探讨 8种医学上重要的念珠菌酵母相胞壁碱溶性 β -葡聚糖水解生成的D -葡萄糖占菌体干重含量百分率的分类鉴定意义。方法 :　采用双波长薄层扫描法 ,测定 6 5株 8种念珠菌及 8种酿酒酵母的标准菌株上述含量值 ,并检测 46株念珠菌临床分离株 ,且与标准株结果相比较。结果 :实验结果经Tukey法统计处理 ,可将 9种菌分为 3个同质性亚群 ,亚群 1:酿酒酵母、克柔、季也蒙、光滑、热带念珠菌 (P =0 .0 6 5 ) ,亚群 2 :克柔、季也蒙、光滑、热带、近平滑、伪热带、星形念珠菌 (P =0 .336 ) ,亚群 3:白念珠菌 (P =1.0 0 0 )。此外 ,酿酒酵母与 8种念珠菌经t检验 ,均有显著性差异。临床分离株与标准株均无显著性差异。结论 :　该指标能在属水平区分念珠菌和酿酒酵母 ,可将 8种念珠菌分为 3个亚群 ;且重复性较好。因此似能作为一种念珠菌分类鉴定研究的化学分类法指标。     

念珠菌生成D-葡萄糖与D-甘露糖含量比值的分析

目的分析念珠菌酵母相全细胞水解生成的D-葡萄糖与D-甘露糖含量比值。方法采用双波长薄层扫描法,测定65株8种医学上重要的念珠菌标准株及酿酒酵母标准菌株8株的酵母相全细胞完全酸水解产物中D-葡萄糖与D-甘露糖含量比值。同时测定了46株念珠菌临床分离株,并与标准株进行了比较。结果经Tukey法统计处理,可将9种菌分成5个同质性亚群。经t检验比较,酿酒酵母和8种念珠菌的结果差异均有显著性;而念珠菌临床分离株与标准株结果差异均无显著性。结论该比值结果能在属水平区分念珠菌和酿酒酵母,并可将8种念珠菌分为4个同质性亚群;且经临床分离株验证,重复性较好。     

应用微卫星对白念珠菌种内分型

目的:用rDNA以外的重复序列(微卫星)对白念珠菌进行种内分型。方法:选取临床分离株20株以及标准株1株,设计针对保守基因CDC3的引物进行PCR,PCR产物连接到载体,转化,然后测序和分型。结果:21株菌株依微卫星型别被分为5种基因型,依片段长度型别分为7型。2株临床分离株和1株标准株经转种10次以后基因型仍然保持稳定。结论:CDC3中的微卫星遗传稳定,可以作为基因分型标记。用该方法可以进行白念珠菌种内分型,将为开展白念珠菌病流行病学调查提供一个方法。     

同位素掺入标记法测定白念珠菌粘附的研究

用３Ｈ－亮氨酸掺入标记白念珠菌（白念）放射计数法（ＲＣ）和菌落形成单位培养法（ＣＦＵ），对比地测定了白念不同细胞浓度的活菌数和其对小鼠肠上皮细胞粘附的变化。结果证实，两法呈平行相关。提示ＲＣ法适合定量测定白念粘附的研究，可作为大样本粘附试验的测定方法，具有快速、简便及精确等优点。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

用流式细胞术研究中药对白念珠菌的抗菌作用

目的 应用流式细胞仪测定中药有效成分小檗碱、黄芩甙、丁香酚和姜黄素对白念珠菌细胞周期的影响。方法 将白念珠菌培养在含不同药物浓度的YEPD培养基中，培养48h，流式细胞仪检测细胞生长周期、DNA荧光强度和细胞体积大小。结果 4种抗真菌中药有效成分对白念珠菌细胞生长周期有不同程度的影响，随着药物浓度的增高，其处于S-G2-M期的细胞比率越低，亦即细胞分裂受抑制越明显。在含药物培养基中生长的真菌细胞的荧光强度减弱，反映了细胞DNA片段的丢失，并随着药物浓度的升高，荧光强度减弱越明显，反映细胞体积大小、折光度和颗粒度的散点图向下和向左移动，随着药物浓度的升高，这种图形变化越明显。结论 中药单体通过抑制细胞分裂发挥抗真菌作用，流式细胞仪可用于抗真菌药物敏感性测定。     

微卫星基因分型法分析生殖器白念珠菌感染的传播特点

目的 建立适用于株间鉴别的白念珠菌快速微卫星基因分型方法,探索生殖器白念珠菌感染特点.方法 采集39例女性和27例男性生殖器念珠菌病患者生殖器、肛管和口腔的白念珠菌分离株.以三色荧光标记引物,PCR扩增白念珠菌保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,行微卫星多态性基因分型.结果 三基因联合分析显示,男女生殖器白念珠菌感染者共获18种基因型,主要致病菌株基因型为116:124、122:131、160:200,占感染者的50%以上.3种共有基因型占71%.女性患者中肛管部位菌株基因型与生殖器部位完全一致的占80%,男性则仅占3.8%.女性患者口腔部位的菌株基因型与生殖器部位完全一致的仅占2.7%,男性未见口腔和生殖器一致的菌株基因型.71%的夫妻共患者间生殖器白念珠菌基因型完全相同,其中80%的致病菌株基因型为两性皆感染的主要致病性白念珠菌.结论 改良的白念珠菌微卫星多态性基因分型法能够特异、准确、稳定和快速地进行菌株间鉴别.生殖器白念珠菌感染存在优势基因型.     

白念珠菌对人血管内皮细胞表面黏附分子表达和细胞因子分泌的影响

目的 观察白念珠菌对人血管内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达及分泌白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)水平的影响.方法 分离健康产妇胎盘脐静脉内皮细胞进行原代培养,细胞长至单层时,与白念珠菌共培养不同时间,再用逆转录-聚合酶链反应法分析内皮细胞表面ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA的表达,用ELISA法检测IL-6、IL-8分泌水平.结果 白念珠菌刺激4h后血管内皮细胞表达ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA明显增加,至8h达到峰值.而IL-6,IL-8的分泌在4h后也明显增加(P<0.05),24h到达高峰(P<0.01).结论 白念珠菌可诱导人血管内皮细胞ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达及促进IL-6、IL-8分泌.     

TLR4在白念珠菌刺激小鼠巨噬细胞释放TNF-α和NO中的作用研究

目的　探求Toll样受体 4(TLR4)在白念珠菌刺激小鼠巨噬细胞系RAW 2 64 .7释放肿瘤坏死因子 α(TNF α)和一氧化氮 (NO)中的作用。方法　①体外培养RAW 2 64 .7,设置处理组 (抗TLR4单克隆抗体组 )、阴性对照组与空白对照组 ,分别给予白念珠菌刺激。②刺激 1h ,3h ,6h ,8h后用酶联免疫吸附试验检测各组分泌的TNF α水平。③刺激 6h后Griess法检测各组产生NO的水平。结果　①刺激 1h后抗体浓度为 2 0 μg/ml处理组分泌的TNF α水平低于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,3h ,6h ,8h后各浓度处理组TNF α水平均低于阴性对照组 (P均 <0 .0 1) ,且呈浓度依赖性 ;② 6h后各浓度处理组NO水平与阴性对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　TLR4在白念珠菌刺激小鼠巨噬细胞释放TNF α中发挥作用 ,而对NO释放没有直接作用。