Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响。方法：构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,转染重质粒后1—5天,SGC7901细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）,细胞形成克隆数明显降低（P〈0．01）,并且有明显的亚二倍体峰出现（P〈0．05）。结论：针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

siRNA干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5表达对人胃癌SGC7901细胞增殖和克隆形成能力的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）表达后对人胃癌SGC7901细胞增殖和克隆形成能力的影响。方法 设计靶向抑制PRMT5表达的特异siRNA（siRNA-1、siRNA-2）,瞬时转染胃癌SGC7901细胞（干扰组）,同时设置转染无义序列的阴性对照组。在瞬时转染48 h后采用Western blotting实验评估siRNA对PRMT5的干扰效果;采用CCK-8法检测siRNA抑制PRMT5表达后胃癌SGC7901细胞的增殖情况;采用EdU法检测siRNA抑制PRMT5表达后胃癌SGC7901细胞的DNA复制情况;采用平板克隆形成实验检测siRNA抑制PRMT5表达后对胃癌SGC7901细胞克隆形成能力的影响。结果 在胃癌SGC7901细胞中,瞬时转染siRNA-1和siRNA-2后PRMT5蛋白的表达水平均显著低于阴性对照组（P＜0.01）,表明两个siRNA具有良好的干扰效果,可用于后续实验。与阴性对照组相比,PRMT5表达干扰后的胃癌SGC7901细胞增殖速率显著下降,差异有统计学意义（P＜0.01）。转染siRNA序列后,PRMT5干扰组（siRNA-1和siRNA-2）的EdU阳性细胞百分比为（16.0±2.0）％和（19.5±3.0）％,远低于阴性对照组的（38.0±4.0）％,差异有统计学意义（P＜0.01）。PRMT5干扰组（siRNA-1和siRNA-2）的克隆形成数分别为（50±6）个和（68±7）个,远低于阴性对照组的（120±11）个,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 通过siRNA抑制PRMT5表达后可显著抑制胃癌SGC7901细胞的增殖和克隆形成能力,为胃癌的临床治疗提供新的策略和理论依据。     

Caveolin-1RNA干扰真核表达载体的构建及其对人类胃癌细胞生物学行为的影响

 目的　构建针对Caveolin-1（CAV1）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体psilence 4.1-CMV-neo-CAV1并转染胃癌细胞株SGC7901,探讨siRNA抑制CAV1表达对人类胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响。方法　根据 GeneBank提供的CAV1基因核苷酸序列,设计并化学合成3对双链siRNA,瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,通过半定量RT-PCR检测各转染细胞CAV1表达,筛选一个有效的siRNA序列。设计并合成能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,构建CAV1基因的RNA干扰真核表达载体,稳定转染胃癌细胞株SGC7901, RT-PCR法鉴定SGC7901细胞中CAV1基因的表达,通过细胞生长曲线、克隆形成实验及流式细胞术检测抑制CAV1的表达对胃癌细胞生长增殖的影响。结果　成功构建CAV1 RNA干扰真核表达载体psilence4.1-CMV-neo-CAV1,稳定转染靶细胞后显著降低CAV1的表达,与转染空载体组比较,增生指数及集落形成率增高,差异有统计学意义（分别为t＝7.98,P＜0.05;t＝13.19,P＜0.01）,生长速度亦增快。结论　RNA干扰胃癌细胞CAV1的表达促进了胃癌细胞生长增殖能力。     

siRNA下调KLF8对胃癌细胞SGC7901增殖能力的影响

目的:探讨KLF8基因特异性siRNA对胃癌细胞株SGC7901增殖能力的影响.方法:通过免疫组织化学、Western blot法、RT-PCR检测胃癌组织标本和胃癌细胞株KLF8的表达;通过基因重组方法构建KLF8的siRNA慢病毒载体,并感染人SGC7901细胞,通过Western blot验证siRNA干扰效率.通过MTT、平板克隆、流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期和凋亡,观察其对胃癌细胞SGC7901增殖能力的影响.结果:KLF8在胃癌组织和细胞株中的表达高于癌旁组织和正常胃上皮细胞,下调KLF8能能够明显抑制SGC7901细胞的增殖,促进细胞G0/G1期阻滞和诱导细胞凋亡.结论:KLF8在促进胃癌细胞SGC7901增殖中发挥重要作用,为胃癌靶向治疗提供理论依据.     

RNA干扰抑制胃癌SGC-7901细胞中Livin基因的表达

背景与目的： 利用RNA干扰(RNAi)技术在体外抑制Livin基因表达,探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性。 材料与方法： 设计靶向Livin基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),构建重组表达质粒pTZU6＋1-siRNA-Livin,并导入SGC-7901细胞,在体外诱导RNA干扰。并分别采用流式细胞术检测细胞周期变化,RT-PCR和免疫化学技术检测Livin基因表达,末端标记细胞凋亡法(TUNEL)检测细胞凋亡。 结果： 重组质粒pTZU6＋1-siRNA-Livin导入SGC-7901细胞株后,细胞S期比例由对照组的42.78％降低至19.15％(P<0.05), G1/G0期细胞由对照组的52.68％增至72.98％(P<0.05);pL1-siRNA质粒处理组细胞的Livin mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05),并出现明显的诱导细胞凋亡。 结论： RNA干扰可抑制SGC-7901细胞靶基因Livin的表达及细胞增殖,并诱导细胞凋亡,为胃癌的基因治疗提供了新思路。     

慢病毒介导CXCR4 RNA干扰对胃癌细胞株SGC7901抑制作用的研究

目的:探讨介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒对SGC7901细胞生长、迁移和侵袭的抑制效应.方法:采用课题组前期构建的介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SGC7901细胞,Q-PCR及蛋白质印迹法检测CXCR4 RNA和蛋白相对含量,MTS评价细胞增殖效应,Transwell小室评价CXCR4 RNA干扰对SGC7901细胞迁移和浸润能力的抑制作用.结果:Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SGC7901细胞可见绿色荧光.Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组CXCR4 RNA和蛋白表达量分别为0.19±0.05和0.28,均低于阴性对照NC组的1.00±0.05和0.99(P=0.000 0)和正常SGC7901细胞组的1.09±0.09和0.97,P=0.001 8.Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组MTS A值为0.76±0.02,低于NC组(0.85±0.01,P=0.012 1)和SGC7901细胞组(0.86±0.01,P=0.008 3).迁移实验显示,Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组细胞数为61.50±7.50,低于NC组(132.00±17.86,P=0.000)和SGC7901细胞组(200.50±23.19,P=0.000).侵袭实验证实,Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组细胞数为0,低于NC组(189.00±61.15,P=0.000)和SGC7901细胞组(266.25±50.26,P=0.000).结论:重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒介导CX-CR4 RNA干扰可抑制SGC7901细胞CXCR4 RNA和蛋白表达,抑制细胞生长,降低肿瘤细胞迁移和浸润能力.     

靶向生存素基因siRNA诱导骨肉瘤细胞株U-2OS的凋亡

目的:体外转录合成生存素(survivin)基因siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U-2OS中抑制survivin基因后细胞增殖及细胞凋亡情况.方法:将U-2OS细胞分为A组(空白对照组)、B组(非特异性转染组)、C组(特异性转染组),在荧光显微镜下观察转染前后细胞形态的改变,用RT-PCR和Western blot法分别检测转染前后survivin基因mRNA和蛋白的干涉效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并比较各组结果.结果:荧光显微镜下可见转染后细胞增殖变慢,凋亡细胞增加;RT-PCR结果显示survivin siRNA明显抑制survivin基因mRNA表达.Western blot法检测C组蛋白阳性表达率比A、B两组显著降低(P＜0.01);特异性转染组的细胞增殖缓慢,与其它两组比较有显著性差异(P＜0.01).流式细胞仪检测C组细胞凋亡率与其他两组比较有显著性差异(P＜0.01).结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制U-2OS细胞中survivin mRNA及蛋白表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.RNA干扰技术为骨肉瘤的基因治疗提供了一种新策略.     

沉默MTA1表达对胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察转移相关基因1（MTA1）基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖和迁移侵袭能力的影响,探讨 MTA1基因在胃癌发生发展中的作用。方法:利用脂质体法将靶向MTA1的小分子干扰 RNA（siRNA） 转染到胃癌细胞株 SGC7901中。运用Real time PCR 和Western blot 技术检测SGC7901细胞内MTA1的 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果:MTA1 siRNA 可有效抑制SGC7901细胞MTA1基因在 mRNA 和蛋白水平上的表达（P﹤0.01）。CCK-8实验表明MTA1 siRNA 转染后细胞增殖不受影响;Transwell小室实验表明细胞迁移和侵袭能力明显下降。结论:沉默MTA1表达可抑制胃癌细胞株 SGC7901迁移和侵袭,而不影响细胞增殖。MTA1在胃癌侵袭转移过程中可能发挥重要作用。     

干扰RNA对HT-29细胞周期和凋亡活性的影响

目的:研究干扰RNA质粒载体对肿瘤细胞的作用.方法:制备了针对FGF3基因的干扰RNA质粒载体(pRNATU6.1/NeoGFP-FGF3),并选用大肠癌细胞株HT-29为实验对象,流式细胞仪观察干扰RNA质粒载体对HT-29细胞周期和凋亡活性的影响.结果:细胞周期分析发现转染pRNATU6.1/NeoGFP-FGF3后,HT-29细胞增殖能力减弱;细胞凋亡实验表明干扰RNA质粒载体有明显的促进肿瘤细胞凋亡作用.结论:干扰RNA质粒载体能明显抑制HT-29肿瘤细胞的增殖,并且能显著促进细胞凋亡.     

蛇毒cystatin基因转染抗人胃腺癌细胞体外侵袭作用的研究

目的:探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)对人胃腺癌细胞SGC7901侵袭转移的抑制作用.方法:采用人工拼接方法合成蛇毒cystatin cDNA,构建pcDNA3.1/sv-cystatin真核表达质粒,经脂质体转染将pcDNA3.1/sv-cystatin质粒和pcDNA3.1质粒分别导入胃腺癌细胞系SGC7901:利用RT-PCR和Western blot检测SGC7901细胞中sv-cystatin基因的表达;应用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验及重建基底膜侵袭实验分析svcystatin表达对SGC7901细胞粘附、运动和侵袭能力的影响.结果:转染sv-cystatin基因后,SGC/sv-cystatin细胞克隆中可检测到sv-cystatin的明显表达,SGC/sv-cystatin细胞的运动能力和体外穿越重建基底膜的能力明显低于转染空载体细胞和未转染的SGC7901细胞,但其体外粘附能力未见明显变化.结论:sv-cystatin基因的表达可使胃癌SGC7901细胞体外运动能力及侵袭能力明显减弱,提示sv-cystatin具有抑制胃癌细胞侵袭转移的作用.     

下调OTX1的表达对胃腺癌SGC－7901细胞系增殖和凋亡的影响

目的：观察沉默胃腺癌细胞系 SGC －7901的 Orthodenticle 人同源盒基因1（orthodenticle homeobox 1, OTX1）对 SGC －7901细胞增殖能力和凋亡情况的影响。方法：构建 shRNA －OTX1重组质粒载体 pGPU6－OTX1,并应用脂质体转染法将其转染入 SGC －7901细胞。qRT －PCR 法检测 OTX1基因的表达;Western blot法检测 OTX1蛋白的含量;CCK －8法检测 pGPU6－OTX1对 SGC －7901细胞增殖能力的影响;Annexin Ⅴ－PE ／7－AAD 双染流式细胞术检测 pGPU6－OTX1对 SGC －7901细胞凋亡的影响。结果：成功将构建的 pGPU6－OTX1转染入 SGC －7901细胞;qRT －PCR 结果显示 pGPU6－OTX1下调 SGC －7901细胞 OTX1基因的表达;Western blot 结果显示 pGPU6－OTX1使 SGC －7901细胞 OTX1蛋白表达降低;CCK －8结果显示 pGPU6－OTX1明显抑制 SGC －7901细胞的增殖能力;流式细胞术结果显示 pGPU6－OTX1能够诱导 SGC －7901细胞凋亡。结论：pGPU6－OTX1能够抑制胃腺癌细胞 SGC －7901的增殖,并诱导凋亡。     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞株SGC7901 hTERT基因表达

背景与目的：胃癌是全人类常见恶性肿瘤之一。在我国，胃癌居各种癌症死亡之首，其总体五年生存率仅15％～20％。在目前尚无有效一级预防措施的情况下，积极探讨有效防治胃癌的方法成为必然趋势。本研究利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi对胃癌细胞增殖的抑制效应。方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入人胃癌细胞系SGC7901细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株。采用real time RT—PCR、MTT和PCR—TRAP法同时检测pGenesil-shRNA—hTERT稳定抑制组和未处理SGC7901细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化。结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SGC7901细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制。结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖，是潜在的肿瘤基因治疗新方法。     

miR-486-5p对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响

背景与目的：既往研究表明微小RNA-486-5p(miR-486-5p)在多种肿瘤的进展中起重要作用,但其在胃癌中作用的研究较少,本研究旨在探讨miR-486-5p对胃癌细胞株SGC7901增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法：使用实时定量PCR(quantification real-time PCR,qRT-PCR)检测胃癌细胞株SGC7901及胃黏膜上皮细胞GES-1中miR-486-5p的表达,构建miR-486-5p过表达质粒,使用脂质体法瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,qRT-PCR检测转染细胞后miR-486-5p的表达丰度,噻唑蓝(MTT)法及流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡情况,Transwell小室迁移实验检测细胞的迁移能力。结果：miR-486-5p在SGC7901细胞中表达明显下调,SGC7901细胞转染miR-486-5p过表达质粒后,miR-486-5p表达明显上调,细胞增殖、迁移能力降低,凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-486-5p可抑制胃癌细胞株SGC7901的增殖和迁移。     

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

目的研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法用PCR扩增出RhoB的全长cDNA，构建RhoB可诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB；脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中，筛选出稳定抗性克隆；Western blot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTT assay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst 33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene／V5-His-RhoB，并经酶切和测序鉴定；转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901／RhoB；米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达，在诱导24小时后蛋白表达最高；细胞增殖试验结果显示，RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制；细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用，可诱导胃癌细胞出现凋亡。     

中期因子在胃癌中的表达与细胞增殖的关系*

目的:研究中期因子（midkine,MK）在人胃癌组织中的表达情况,探讨其与胃癌细胞增殖的关系及分子机制。方法:收集70例临床胃癌组织标本及其配对癌旁正常胃黏膜组织标本,应用实时定量PCR 技术检测中期因子mRNA 表达水平。构建中期因子逆转录病毒载体,经DNA测序正确后,应用脂质体转染法将病毒载体转染GP293 病毒包装细胞,48h 后收集病毒上清。分别用不同浓度的病毒上清感染人胃癌SGC 7901细胞,应用MTT 法检测细胞增殖速率。应用免疫印迹技术检测中期因子影响胃癌细胞增殖的分子机制。结果:有65.7%（46/70）胃癌组织中中期因子表达量为癌旁正常胃黏膜组织2 倍以上,而仅有11.4%（8/70）癌旁正常胃黏膜组织中中期因子表达量为胃癌组织2 倍以上,二者统计学有显著性差异（P<0.05）。 随着感染病毒浓度的增加,中期因子蛋白表达水平逐渐增加,同时SGC 7901细胞增殖速率逐渐加快。随着MK蛋白表达水平的增加,泛素连接酶CBL 、CBL-b 蛋白表达水平下降,磷酸化Akt蛋白表达水平增加。结论:中期因子在胃癌组织中呈高表达;应用其逆转录病毒感染SGC 7901细胞可显著促进胃癌细胞增殖;中期因子以剂量依赖性方式下调泛素连接酶CBL 、CBL-b 表达,同时伴有Akt活性的上调,推测中期因子通过下调CBL 、CBL-b 蛋白表达,解除其对PI 3 激酶的泛素化降解作用,从而激活PI 3K/Akt信号通路,促进肿瘤细胞的生长。      

RNAi-mediated silencing of CD147 inhibits tumor cell proliferation,invasion and increases chemosensitivity to cisplatin in SGC7901 cells in vitro

Background

CD147 is a widely distributed cell surface glycoprotein that belongs to the Ig superfamily. CD147 has been implicated in numerous physiological and pathological activities. Enriched on the surface of many tumor cells, CD147 promotes tumor growth, invasion, metastasis and angiogenesis and confers resistance to some chemotherapeutic drugs. In this study, we investigated the possible role of CD147 in the progression of gastric cancer.

Methods

Short hairpin RNA (shRNA) expressing vectors targeting CD147 were constructed and transfected into human gastric cancer cells SGC7901 and CD147 expression was monitored by quantitative realtime RT-PCR and Western blot. Cell proliferation, the activities of MMP-2 and MMP-9, the invasive potential and chemosensitivity to cisplatin of SGC7901 cells were determined by MTT, gelatin zymography, Transwell invasion assay and MTT, respectively.

Results

Down-regulation of CD147 by RNAi approach led to decreased cell proliferation, MMP-2 and MMP-9 activities and invasive potential of SGC7901 cells as well as increased chemosensitivity to cisplatin.

Conclusion

CD147 involves in proliferation, invasion and chemosensitivity of human gastric cancer cell line SGC7901, indicating that CD147 may be a promising therapeutic target for gastric cancer.     

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northern blot和半定量RT—PCR,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达;将反义核酸转染SGC7901／VCR细胞,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达;以流式细胞仪检测细胞周期的变化,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC7901／VCR与非耐药细胞相比,ZNBDl基因的表达明显增高。转导株antiZNRDl—SGC7901／VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株,C1期细胞比例增加而S期比例减少,生长受到抑制,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比,ZNRDl基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRDl蛋白的表达,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药性。