人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子（hTERT）调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体，并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法：利用基因重组方法将TRAIL基因克隆人带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用G418筛选获得阳性克隆；应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术（FCM）结合间接免疫荧光、RT—PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论：成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体，并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达，为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。     

重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其诱导喉癌细胞株Hep2凋亡的效应

目的: 研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法: 利用已有编码凋亡诱导功能区的TRAILcDNA片断的表达载体pRNDE2 -1和IL- 2信号肽基因序列, 扩增IL- 2信号肽基因和TRAIL基因的融合基因, 并克隆入真核表达载体pGL3 181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游, 构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人喉癌细胞株Hep2中, 以台盼蓝拒染法和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳, 观察转染的Hep2细胞的凋亡。结果: 构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 其表达产物能诱导喉癌细胞Hep2凋亡。结论: 成功地构建了重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

分泌型重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其凋亡效应

目的 研究新型凋亡因了－TRAIL基因在肿瘤基因治疗中的作用。方法 用RT－PCR法,从Balb/c小鼠脾脏的RNA中扩增出编码凋亡诱导功能区的TRAILcDNA片段,并克隆入pUC－T载体中。经DNA测序鉴定正确后,亚克隆人真核表达载体pSEC－hy-gromycin的免疫球蛋白κ链信号肽编码区的下游,形成含有κ链信号肽与TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,构建可分泌表达TRAIL的重组真核表达载体pSEC／TRAIL。该重组载体经阳离子脂质体转染入小鼠前胃癌细胞株MFC615中,以台盼蓝拒染法和HOECHST33258荧光染色法,观察重组TRAIL对肿瘤细胞的凋亡效应。结果 TRAIL的cDNA克隆成功,构建了可高效分泌表达可溶性TRAIL的重组真核表达载体pSEC／TRAIL,该产物能显著促进MFC615肿瘤细胞凋亡。结论 重组真核表达载体pSEC／TRAIL的成功构建,为研究肿瘤的基因治疗提供了理想的工具。     

GRIM-19基因的克隆及其对小鼠前列腺癌细胞株的促凋亡作用

目的构建GRIM-19基因真核表达质粒,探讨GRIM-19基因转染对小鼠前列腺癌rm-1细胞的促凋亡作用。方法采用RT-PCR及重组DNA技术构建pcDNA-GRIM-19真核表达质粒,体外进行基因转染。形态学观察,DNAladder检测转染后rm-1细胞凋亡,RT-PCR方法检测rm-1细胞caspase-3活性。结果扩增出GRIM-19cDNA全长,测序结果与GenBank记载基本一致。转染rm-1细胞48h后证明其能在真核细胞表达,形态学及共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组出现明显的细胞凋亡,并出现典型的DNAladder。转染pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组caspase-3表达强度较对照组及空质粒组明显上调(P<0.05)。结论成功克隆并构建鼠GRIM-19基因真核表达载体pcDNA3.1-GRIM-19,该载体可诱导鼠rm-1细胞凋亡。其凋亡机制与caspase-3酶活性有关。     

人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

hTERT启动子驱动的TRAIL诱导宫颈癌细胞的凋亡作用

目的：探讨端粒酶（hTERT）启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对宫颈癌细胞生长抑制的作用。方法：脂质体转染将hTERT-TRAIL转染至宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测TRAILmRNA的表达;通过MTT、流式细胞术检测稳定转染细胞的生长情况,电镜观察转染细胞的超微结构。结果：转染真核表达载体hTERT-TRAIL组细胞中TRAILmRNA细胞表达量高于对照组（P〈0.05）;hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的抑制率高于CMV-TRAIL组和对照组（P〈0.05）;hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的凋亡率明显高于转染CMV-TRAIL组和对照组（P〈0.01）;电镜结果显示,hTERT-TRAIL对细胞作用是以细胞凋亡为主。结论：hTERT启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人宫颈癌细胞的生长有明显的抑制作用和诱导凋亡作用,为宫颈癌的研究奠定基础和临床治疗提供思路。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

hTERT核心启动子调控的hNIS重组腺病毒的构建与鉴定

目的：构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子调控的人钠碘转运体（hNIS）基因重组腺病毒,并初步鉴定。方法：将hTERT核心启动子从hTERT/pcDNA3.1（＋）质粒中切出,亚克隆至含全长hNIS cDNA序列的质粒载体FL＊-hNIS/pcDNA3,应用限制性内切酶将hTERT-hNIS片段切出后连入穿梭质粒载体pAdTrack,应用AdEasy系统构建出重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS。同时,构建CMV启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV-hNIS作为阳性对照。应用RT-PCR方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性。结果：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS并经PCR验证正确。RT-PCR证实hNIScDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来。结论：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS;hTERT核心启动子在转染的肺癌A549细胞中具有转录活性。为下一步的碘治疗实验提供了实验依据。     

P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制。方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变。并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2—630共转染SACC-83细胞，测定转染细胞荧光素酶报告基因活性。结果1．瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体p△E1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后，其P53基因mRNA的表达明显增强；2．基因转染后，SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低。3．P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后，其荧光素酶活性显著下降。结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性，并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定

目的用巢式PCR从人类基因组获取miR-200c及侧翼序列,构建hsa-miR-200c重组体,转染卵巢癌细胞系SKOV3,检测其对E-钙粘蛋白表达的影响,为miR-200c对肿瘤细胞基因表达调控奠定基础。方法据microRNA数据库设计人miR-200c及侧翼引物,提取人细胞基因组进行PCR和巢式PCR获得miR-200c及侧翼共307个碱基序列,连接到pIRES2-EGFP载体中,测序鉴定后再将的miR-200c基因经慢病毒载体系统转染SKOV3细胞,检测miR-200c过表达对卵巢癌细胞E-钙粘蛋白表达的影响。结果成功扩增出miR-200c及侧翼共307个碱基序列,构建的重组体pIRES2-EGFP-miR-200c测序正确,转染SKOV3细胞后miR-200c过表达引起E-钙粘蛋白表达增多。结论巢式PCR技术能有效地从基因组中扩取miR-200c及侧翼片段用以构建miR-200c表达载体,miR-200c过表达可引起卵巢癌SKOV3细胞E-钙粘蛋白表达增多,可能导致细胞间黏附性增高。     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

人PD-1Δex3基因的克隆、表达及其生物学活性的鉴定

目的:构建表达人PD-1Δex3(ΔPD-1)基因的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法:通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1Δex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得ΔPD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-1和pIRES2-EGFP/ΔPD-1并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入293T细胞;流式细胞术(FCM)检测转染细胞膜表面PD-1的表达;Western blot法检测培养上清中可溶性PD-1(sPD-1)的表达;间接免疫荧光实验分析ΔPD-1蛋白与PD-1两个配体PD-L1和PD-L2的结合。结果:酶切和测序结果均证实插入的基因序列正确,成功构建两个真核表达载体;FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无sPD-1蛋白,而ΔPD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1;间接免疫荧光实验结果表明,ΔPD-1蛋白能够与PD-1两种配体产生特异性结合。结论:成功进行PD-1Δex3基因的真核表达,证实PD-1Δex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1Δex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础。     

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论 :tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。