CⅡTA基因在五种人类恶性血液病细胞株细胞中的表达及意义

目的:探讨5种血液病细胞株细胞的HLA-Ⅱ类抗原表达,以及对IFN-γ诱导HLA分子表达的反应性与MHCⅡ类分子反式激活因子 (CⅡTA) 表达的关系.方法:采用流式细胞术和免疫组化法检测肿瘤细胞HLA分子及CⅡTA 蛋白的表达,RT-PCR检测肿瘤细胞CⅡTA基因表达.混合淋巴细胞反应检测肿瘤细胞刺激外周血T细胞反应的能力.结果:肿瘤细胞HLAⅡ类分子表达与CⅡTA表达一致; 结构型或诱导型表达CⅡTA的肿瘤细胞,经IFN-γ作用后其HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达增高;IFN -γ诱导后仍不表达CⅡTA的肿瘤细胞,其对IFN-γ促HLAⅡ表达的作用不反应.Jurkat诱导后刺激T细胞表达高水平的IL-2 mRNA.结论:某些恶性血液病细胞株细胞对IFN-γ不能诱导HLA分子表达与CⅡTA诱导型表达缺陷有关,表明CⅡTA参与调控肿瘤细胞 HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达,可能在肿瘤免疫逃逸中起重要作用.     

抗ADAR1锤头状核酶的计算机设计及其可控真核表达载体的构建

目的：选择针对ADAR1 mRNA的5’非编码区(NCR)和翻译起始区的锤头状核酶(ribozyrme，Rz)切割位点，构建针对ADAR1的Rz可诱导真核表达载体，旨在knock down ADAR1基因，开展ADAR1基因功能的研究．方法：应用计算机辅助设计，根据能量最低化原理，以ADAR1 mRNA的5’NCR和翻译起始区为靶序列，预测其二级结构，选择理想的Rz切割位点，设计并合成锤头状核酶．采用亚克隆法首先将人工合成的Rz DNA序列插入原核载体p1.5的XbaI和KpnI位点获得Rz原核表达质粒pRz-613；再将pRz-613中ADAR1Rz基因连同其两端的自剪切Rz序列一起克隆入可诱导真核表达载体pTRE的SacⅡ和EcoRI位点得到真核表达质粒pRz—ADAR1；通过酶切电泳和测序检查质粒重组后序列情况．结果：选出ADAR1 mRNA的第208位为Rz切点，设计并合成了RzDNA序列.所构建的pRz—ADAR1经酶切电泳鉴定显示，插入Rz序列大小约为180kb，和预期结果相同；经测序证实Rz序列正确．结论：利用计算机辅助设计，成功构建了针对ADAR1锤头状Rz可诱导真核表达载体pRz—ADAR1．     

MHCⅡ类反式激活因子在上调HepG2细胞HLAⅡ类分子表达中的作用

目的探讨主要组织相容性复合物(major histocom patibility complex,MHC)Ⅱ类反式激活因子(classⅡtrans-activator,CⅡTA)在调控HepG2细胞HLAⅡ类分子表达中的作用。方法将含CⅡTAcDNA的真核表达载体EBS-NPL-CⅡTA和不含CⅡTAcDNA的空载体EBS-NPL分别转染至HepG2细胞。用RT-PCR技术检测未经转染的HepG2细胞、转染EBS-NPL-CⅡTA及空载体EBS-NPL的HepG2细胞CⅡTA mRNA的表达,并用间接细胞免疫荧光技术及流式细胞技术检测其3种HLAⅡ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达。结果未经转染的HepG2细胞和转染空载体EBS-NPL的HepG2细胞均无CⅡTA mRNA和HLAⅡ类分子的表达。转染EBS-NPL-CⅡTA后的HepG2细胞出现CⅡTA mRNA表达,并表达3种HLAⅡ类分子。结论CⅡTA是调控HepG2细胞是否表达HLAⅡ类分子的关键因子,HepG2细胞不表达HLA-Ⅱ类分子与其缺乏CⅡTA表达有关,为进一步研究CⅡTA在肝癌治疗中的作用奠定基础。     

RNAi抑制大鼠骨髓源树突状细胞MHC-Ⅱ表达的研究

目的:应用RNAi技术探讨靶向主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原反式转录激活因子(C Ⅱ TA)的shRNA质粒载体抑制大鼠骨髓源树突状细胞(DC)表面MHC-Ⅱ类抗原表达的可行性.方法:体外培养大鼠骨髓源DC:流式细胞仪检测DC表面抗原MHC-Ⅱ、OX-62表达情况;体外合成针对C Ⅱ TA mRNA序列特异性C Ⅱ TA shRNA并构建质粒,在阳离子脂质体介导下转染DC;流式细胞仪检测细胞表面抗原MHC-Ⅱ表达水平的变化.结果:(1)经体外培养DC可用于后续反应,体外构建质粒成功;(2)流式细胞仪检测显示C Ⅱ TA-shRNA质粒组中DC转染后MHC-Ⅱ的抗原水平均较对照组明显降低.结论:利用C Ⅱ TA shRNA质粒载体沉默C Ⅱ TA基因从而下调MHC-Ⅱ的表达的策略是可行的,为降低移植排斥反应提供了实验依据.     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

Ⅱ类主要组织相容性抗原在博来霉素致大鼠纤维化肺组织中的表达

目的:在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型上,观察主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子及其上游调控因子Ⅱ类反式激活蛋白(class Ⅱ transactivator,CⅡTA)表达水平的变化,探索肺纤维化发病可能的免疫机制.方法:在大鼠气管内灌注博来霉素(纤维化组)或生理盐水(对照组),分别于第7、第28天处死大鼠,取大鼠肺组织行HE染色和Masson染色,用生化法测定肺组织羟脯氨酸含量,免疫组化sP法染色观察肺组织MHC Ⅱ类分子表达,利用Taqman探针方法实时PCR(real-time PCR)技术测定肺组织总CⅡTA及Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型CⅡTA mRNA表达.结果:(1)第7、第28天时纤维化组肺组织MHCⅡ阳性细胞百分比均较对照组增加[(0.10±0.03)vs(0.06±0.02),P<0.05;(0.15±0.03)vs(0.06±0.01),P<0.01];纤维化组第28天较第7天增加[(0.15±0.03)vs(0.10±0.03),P<0.05];(2)第7天时,纤维化组大鼠肺组织总CⅡTA较对照组升高170.4%[(2.89±1.07)vs(1.07±0.46),P<0.05],Ⅰ型CⅡTA较对照组升高258.8%[(0.77±0.38)vs(0.21±0.09),P<0.05],Ⅳ型CⅡTA较对照组降低87.2%[(0.39±0.15)vs(3.01±0.79),P<0.01];第28天时,纤维化组大鼠肺组织总CⅡTA较对照组升高98.6%[(4.14±1.15)vs(2.08±0.76),P<0.05],Ⅰ型CⅡTA较对照组升高137.1%[(0.79±0.34)vs(0.33±0.23),P<0.05],Ⅳ型CⅡTA仍较对照组低,但差异无统计学意义[(2.98±0.92)vs(3.95±0.93),P0.05].其中,纤维化组肺组织Ⅳ型CⅡTA在第28天时较第7天时升高667.3%[(2.98±0.92)vs(0.39±0.15),P<0.01].Ⅲ型CⅡTA在各时期与对照组比较差异均无统计学意义.结论:肺组织MHC Ⅱ/CⅡTA体系参与了博来霉素诱导的肺纤维化的病理生理过程.     

核酶对人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖和TIMP-1表达的影响

目的:探讨核酶对人金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)基因表达的特异性抑制作用,以寻找治疗增生性瘢痕的新方法.方法:应用特异切割TIMP-1的嵌合型核酶基因克隆pU6-Rz182转染增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar derived fibroblasts,HSF),G418筛选稳定表达核酶的细胞克隆,MTT法检测并绘制细胞生长曲线,观察核酶对细胞生长的影响;RT-PCR检测核酶对靶基因TIMP-1表达的抑制.结果:在mRNA水平,与正常对照组相比,稳定表达活性核酶Rz182的HSF中TIMP-1的表达被抑制了87.9%,而点突变核酶抑制达36.4%,两者之间差异非常显著(P<0.01).HSF细胞生长进入平台期后,转染核酶基因组与点突变组及对照组相比,活细胞数显著降低(P<0.01),而点突变组与对照组无明显差异.结论:核酶U6Rz182能特异地抑制HSF中TIMP-1的表达,并使HSF的增殖受到抑制.     

CD28抗体协同表达MHC Ⅱ类分子的甲状腺细胞刺激自身T细胞增殖和活化

目的 探讨表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的甲状腺细胞如何发挥抗原递呈功能.方法 分离表达MHCⅡ类分子的转基因鼠和对照小鼠的甲状腺细胞,免疫磁珠方法分离其自身T细胞,在体外共同培养,并加入抗CD28抗体.免疫荧光染色,流式细胞分析检测T细胞的增殖和活化.ELISA方法检测培养上清的细胞因子浓度.结果 单纯表达MHC Ⅱ类分子的转基因小鼠甲状腺细胞不能刺激自身T细胞的增殖和活化,然而当加入抗CD28抗体后,表达MHC Ⅱ类分子的甲状腺细胞能刺激自身T细胞的增殖、活化及细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的分泌,而T细胞对野生型小鼠的甲状腺细胞无反应.结论 加入协同刺激信号后,表达MHCⅡ类分子的甲状腺细胞也可刺激T细胞增殖活化及分泌细胞因子,具有递呈抗原的能力.     

实验性病毒性心肌炎心肌MHCⅡ类抗原的表达

[目的]研究病毒性心肌炎(VMC)心肌组织相容性抗原Ⅱ类(MHCⅡ类抗原)的表达特点,探索轻度、不典型VMC的法医病理学诊断方法.[方法]以1035TCID50的CoxsackieB3病毒接种Balb/c小鼠,诱导小鼠轻度VMC.用免疫组化技术检测VMC小鼠心肌MHCⅡ类抗原的表达.[结果]VMC小鼠心肌组织内MHCⅡ类抗原异常表达,部分心肌细胞膜局灶性MHCⅡ类抗原阳性.[结论]心肌MHCⅡ类抗原的异常表达参与了轻度VMC的发病机制;心肌MHCⅡ类抗原-LSAB染色可望成为诊断轻度、不典型VMC的免疫病理学指标.     

小儿哮喘与树突状细胞免疫分子表达的相关性

目的比较哮喘患儿与正常DCs表达协同刺激分子（B7—1和B7—2）和主要组织相容性复合体分子（MHCⅠ和Ⅱ类分子）的水平。方法分离DCs,采用酶免疫标记技术分别检测并比较各组DEs协同刺激分子（B7—1和B7—2）、主要组织相容性复合体分子（MHCⅠ和Ⅱ类分子）表达率。结果DCs细胞表面B7—1表达率在哮喘组高于对照组,分别为（26．02±7．26）％和（18．17±5．21）％（P〈0．05）;而哮喘组DCs袁面B7—2表达率低于对照组分别为9．22±2．15％和16．18±3．81％。DCs表面MHC—1分子表达率在小儿哮喘组和对照组分别为52．02±12．18％和58．62±9．26％,差异无统计学意义（P〉05）;DEs表面MHC～Ⅱ表达率在小儿哮喘组和对照组分别为56．26±8．37％和61．08±11．95％,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论小儿哮喘的免疫学发生机制与DCs协同刺激分子表达功能异常密切相关。     

In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases

Dozensofstudieshavedemonstratedthattheab normalexpressionofmajorhistocompatibilitycomplex(MHC)Ⅱmoleculeswasassociatedwithmanydis eases ,suchasrheumaticarthritis ,immunohepatitis ,autoimmunediseaseofcentralneuralsystem[1- 3] .Morerecently ,anti nucleicacidofMHCⅡmoleculeswasshowntoinhibittheexpressionofMHCⅡmolecules,buttheinhibitoryeffectivenesswaslessthan 30 % .Therearecodominanceandmultipleal leleforMHCⅡmoleculeswhichleadtotheircompli catedpolmorphism ,soitisdifficulttorepressexpres si…     

<Emphasis Type="Italic">In vitro</Emphasis> biological activity of anti-C II TA hammerhead ribozyme—A novel approach for autoimmune diseases

Summary This study investigated the feasibility of using an hammerhead ribozyme against C II TA, a major regulator of MHC II antigens, to repress the expression of MHC II molecules on Hela cells. A hammerhead ribozyme (Rz464) specific to 463–465 GUC triplet of C II TA and its target gene were transcribed, then mixed up and incubatedin vitro. The cleavage products were analyzed by PAGE and silver-staining. Rz464 was then inserted into the pIRES2-EGFP vector (pRz464). Stable transfectants of Hela with pRz464 were tested for class II MHC induction by recombinant human interferon-gamma (IFN-γ). mRNA of C II TA was measured by RT-PCR. Our results showed that Rz464 could exclusively cleave C II TA RNA. When induced with IFN-γ, the expression of HLA-DR,-DP,-DQ on pRz464⁺ Hela was induced, and the mRNA content of C II TA decreased too. It is concluded that Rz464 could inhibit C II TA and thus the family of genes was regulated by C II TA: MHC II molecules. These results provided insight into the future application of Rz464 as a new nucleic acid drug against auto-immune diseases. LIU Fang, female, born in 1976, Postgraduate Student This project was supported by the Key Sub-projects of Science and Technology Development Fund of Shanghai Municipality (No. 00DJ14001-8).     

HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响

目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ 交换器（NHE）-1表达和活性，pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达，pHi和Na^ /H^ 交换活性变化。结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE-1mRNA表达减少，Na^ /H^ 交换活性降低，同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE-1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化。     

联合抗Fas核酶和CD80-免疫球蛋白G 融合蛋白阻断小鼠急性粒-单核白血病细胞逃逸T细胞杀伤

目的研究抗Fas锤头状核酶下调细胞毒T细胞(CTL)的Fas表达,以及CD80-免疫球蛋白G(CD80-IgG)融合蛋白增加急性粒-单核白血病细胞表面的CD80分子表位对CTL杀伤急性粒-单核白血病细胞能力的影响.方法构建可有效切割Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒,通过电穿孔法导入小鼠脾脏T细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测T细胞Fas的表达;同时构建pcDNA/CD80-IgG融合基因真核表达载体,采用脂质体技术导入中国地仓鼠卵巢细胞株(CHO)细胞中,并采用免疫亲和层析法纯化CHO细胞上清中的CD80-IgG融合蛋白,用其孵育急性粒-单核白血病细胞株(WEHI-3)后,与上述转染Fas mRNA锤头状核酶的T细胞进行同种异体白血病细胞和淋巴细胞混合培养;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)检测T细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝微量反应比色法(MTT法)检测T细胞增殖和CTL体外杀伤WEHI-3细胞的能力.结果凝胶图像分析小鼠脾脏T细胞Fas 蛋白电泳条带的灰度比值显示以对照组为1,空载体(pEGFPC1)和Fas核酶RZ596重组真核表达载体(pEGFP-RZ596)转染组分别为0.98和0.45(P＜0.01);当转染pEGFP-RZ596的小鼠脾脏T细胞与高表达Fas配体的(64%±3%)WEHI-3细胞混合培养后,T细胞凋亡率为37%,对WEHI-3细胞的杀伤活性为67%,而对照及转染pEGFPC1小鼠脾脏T细胞组的凋亡率和对WEHI-3细胞的杀伤活性分别为88%、84%(P＜0.01)和32%、31%(P＜0.01).WEHI-3细胞表面CD80表达率仅为5.1%±0.4%,经CD80-IgG融合蛋白预孵育后增至27.4%±2.2%(P＜0.01);小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育和未孵育的WEHI-3细胞杀伤率分别为64%和49%(P＜0.01).转染Fas核酶的小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育的WEHI-3细胞杀伤率增至82%(P＜0.01).结论联合抗Fas核酶和 CD80-IgG融合蛋白能使小鼠CTL免于FasL-Fas途径的凋亡;并显著增强其杀伤急性粒单核白血病细胞的效应.     

应用PCR／SSO方法分析湖南籍汉族人HLA－DR，DQ，DP的DNA多态性

采用ＰＣＲ／ＳＳＯ方法分析了６７例湖南籍汉族正常人中ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＱ，ＤＰ位点共１０５个等位基因的分布情况。在６７例检出的７２个等位基因中，其部份频率明显不同于美国白人、黑人和巴西混血人种。提示湖南汉族人与美国白人、黑人和巴西混血人种间存在明显的种族差异。     

CD74基因转染对内皮细胞特性的影响

目的探讨CD74基因在HUVEC的转染条件和CD74基因转染对细胞特性及功能的影响,为深入研究基于调节CD74表达的生物治疗打下基础。方法 （1）pCMV-CD74质粒转染前后ECV304细胞功能相关基因（HLA-A、HLA-DR、IFNGR）表达的检测：采用Real-time RT-PCR比较转染前后脐静脉内皮细胞各功能相关基因的表达;（2）应用Real-time RT-PCR分析软件分析实验数据。结果 Real-time RT-PCR结果显示,转染前后ECV304细胞HLA-A△Ct值分别为9.4881和12.1097,2-△△Ct为6.1543大于2,说明转染前后HLA-A表达有显著差异;IFNGR△Ct值分别为4.9828和5.5228,2-△△Ct为1.4539小于2,转染前后无显著差异;HLA-DR△Ct值分别为14.1098和14.7924,2-△△Ct为1.3036小于2,转染前后无显著差异。结论人脐静脉内皮细胞ECV304表达HLA-A、HLA-DR、IFNGR和CD74mRNA;pCMV-CD74转染可增加ECV304细胞CD74基因和膜分子的表达,增加HLA-A基因的表达,但不增加HLA-DR和IFNGR的表达,为深入探讨CD74基因与内皮细胞功能的相关性提供实验数据。