治疗性抗体Fc融合蛋白药物研究进展

抗体融合蛋白已成为生物工程治疗药物中最成功的一员.其中的Fc融合蛋白,是一类通过基因工程平台技术将抗体的Fc部分与药物的活性成分融合表达而产生的蛋白.虽然构建Fc融合蛋白的初衷是为了延长其半衰期,但大量研究表明,Fc部分也参与免疫调节过程,引起一些免疫效应.随着生物治疗药物研究的飞速发展,Fc融合蛋白药物研究也取得了很大进展.此文从Fc融合蛋白的设计目的、设计原理、作用机理以及质量控制方面,对治疗性Fc融合蛋白药物的研究进展做一介绍.     

以IgE/FcεRI信号通路为靶标治疗变态反应性疾病研究进展

变态反应性疾病已成为全球性的社会卫生问题,IgE与靶细胞表面高亲和力受体FcεRI结合是I型变态反应的关键步骤。针对IgE/FcεRI信号通路重要靶点进行药物设计是当前治疗变态反应性疾病药物研究的热点,主要集中在以IgE、IgE高亲和力受体FcεRI以及信号通路关键信号分子为靶点的抗体、多肽、疫苗、融合蛋白及小分子化合物等相关药物研究。本文综述了近年来以IgE/FcεRI信号通路为靶点的代表性药物在变态反应性疾病中的作用及其机制。     

融合蛋白技术在生物医药领域中的应用

在治疗性药物的研发中,效应分子与人免疫球蛋白IgG1 Fc片段或人血清白蛋白形成的融合蛋白疗效不变,但体内半衰期明显延长、药物耐受性增加、副作用减少.在疫苗研发中,抗原分子与毒素分子或Fc形成的融合蛋白是很好的新型疫苗,并能激发细胞免疫.     

融合蛋白技术在生物医药领域中的应用

在治疗性药物的研发中,效应分子与人免疫球蛋白IgG1 Fc片段或人血清白蛋白形成的融合蛋白疗效不变,但体内半衰期明显延长、药物耐受性增加、副作用减少.在疫苗研发中,抗原分子与毒素分子或Fc形成的融合蛋白是很好的新型疫苗,并能激发细胞免疫.     

一种新型融合蛋白RANKL-Fc的表达和纯化

目的:研究一种新型融合蛋白核转录因子NF-κB受体激动剂配体-免疫球蛋白Fc(RANKLFc)的表达和纯化。方法:通过聚合酶链反应(PCR)将RANKL(140~317)蛋白片段的DNA片段和人源免疫球蛋白Ig G Fc(1~232)片段的DNA片段放大,并把它们同时亚克隆到哺乳动物细胞表达载体(PCDNA3.1)。将构建好的表达载体在哺乳动物CHO细胞进行表达、纯化。通过细胞染色和流式细胞仪分析融合蛋白RANKL-Fc分别与RANKL,Fc RII相互作用。结果和结论:在CHO-K1细胞中成功表达融合蛋白RANKLFc,该蛋白纯化纯度超过90%。融合蛋白RANKL-Fc能分别与RANKL,Fc RII相互作用,结果表明该融合蛋白是以RANKL/RANK通路为靶向的潜在的活性蛋白。     

Fc受体结合型与非Fc受体结合型CD3单抗的制备

目的 研究Fc受体结合型与非Fc受体结合型CD3单抗的制备及单抗的特性.方法 利用杂交瘤细胞株扩增,使用体外培养法制备Fc受体结合型CD3单抗,利用动物体内诱生法制备非Fc受体结合型CD3单抗.使用亲和层析法纯化抗体并与市售的CD3单抗比较,行淋巴细胞培养、流式细胞术等了解Fc受体结合型与非Fc受体结合型CD3单抗的特性.结果 使用体外培养法制备蛋白G琼脂糖纯化了Fc受体结合型CD3单抗;使用动物体内诱生法制备A蛋白亲和层析法纯化了非Fc受体结合型CD3单抗;CD3单抗与市售的CD3单抗一致;Fc受体结合型与非Fc受体结合型CD3单抗的增殖及T细胞受体内化效应和文献报道一致.结论 利用杂交瘤细胞株扩增并成功制备了Fc受体结合型与非Fc受体结合型CD3单抗,并为后续工作的进行奠定了良好的基础.     

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的  表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域（receptor binding domain,RBD）-Fc融合蛋白,并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法  将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中融合表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠,通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果  10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答,该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合,进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体,中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论  制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性,可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。     

真核表达重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白的制备和活性鉴定

目的 制备真核表达小鼠白细胞介素15(IL-15)和IgGγ1 Fc段融合蛋白,并探讨其对抗原特异性CD8+T细胞的作用.方法 运用RT-PCR方法,从B6小鼠脾细胞中分离小鼠IL-15和IgG γ1绞链区-CH2-CH3 Fc cDNA.在IL-15 3'端和Fc 5'端引入BamH I酶切位点,将IL-15和Fc直接连接,构建小鼠IL-15/Fe融合蛋白基因,再连接到真核表达质粒载体pcDNA3.1(a+)上,转化CHO-S细胞表达、纯化后,研究其活性.结果 融合蛋白486 bp的编码由162个氨基酸组成,其中含48个信号肽氨基酸的小鼠IL-15前体蛋白和由681 bp编码227个氨基酸的IgGγ1-CH2-CH3功能区构成;表达蛋白在IL-15信号肽引导下能高效分泌到培养液中,有二聚体和三聚体两种天然结构,单体分子量约50 kDa,能特异性的结合IL-15R并抑制抗原诱导的CD8+T细胞的增殖反应.结论 成功构建了小鼠IL-15/Fc融合蛋白真核表达载体,并在CHO-S细胞中得到高效表达.此融合蛋白具有较高的生物学活性,可有效地抑制抗原特异性CD8+细胞的增殖反应.     

重组Exendin-4-胰高血糖素样肽1/IgG4(Fc)融合蛋白的表达和活性研究

目的  构建表达长效胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide 1,GLP-1）受体激动剂重组Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)融合蛋白的质粒载体,并研究该融合蛋白的活性。方法  将编码Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)的重组基因插入表达载体pOptiVEC™-TOPO^®来构建重组质粒Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)-pOptiVEC™-TOPO^®。将构建的重组质粒转染CHO/DG44细胞并收获表达产物后,分别用亲和层析法和免疫印迹法对表达产物进行纯化和检测。通过胰岛素释放实验确认重组融合蛋白对INS-1细胞胰岛素分泌的影响,同时在CD1小鼠中研究该融合蛋白对血糖的调节作用。结果  转染重组质粒的CHO/DG44细胞可成功表达Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)。蛋白质印迹法检测显示,纯化的表达产物的相对分子质量（M_r）与预期相符（重组融合蛋白单体和二聚体的M_r分别约为35 000和70 000）。胰岛素释放实验表明,在葡萄糖浓度恒定的情况下INS-1细胞分泌的胰岛素量随重组融合蛋白浓度的升高而增加。CD1小鼠实验显示,重组融合蛋白对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖具有调节作用,Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)处理的糖尿病小鼠的血糖明显低于对照糖尿病小鼠（F=3194,P＜0.01）。结论  Exendin-4-GLP-1/IgG4(Fc)具有天然GLP-1的活性,可作为GLP-1受体激动剂用于2型糖尿病的治疗。     

重组人Ⅱ型TNF-α受体-抗体融合蛋白对胶原诱导性关节炎模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB信号表达的影响

目的:探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)对胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB信号表达的影响。方法:将40只6周龄的雌性Wistar大鼠按照随机数表法随机分为空白组、模型组、醋酸泼尼松对照组和rhTNFR:Fc治疗组,每组10只。制备CIA模型,以Western blotting法检测关节滑膜细胞NF-κB/P65、p-ⅠκBα表达的情况。结果:rhTNFR:Fc治疗组和醋酸泼尼松对照组可下调CIA大鼠滑膜细胞NF-κB/P65、p-ⅠκBα的表达,与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论:rhTNFR:Fc可通过降低CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、p-ⅠκBα蛋白表达以达到缓解炎症的作用。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对脂多糖致大鼠急性肺损伤的保护作用

摘要目的：探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体．抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）对脂多糖（LPS）致大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。方法：建立大鼠急性肺损伤模型，随机分为对照组、rhTNFR：Fc组、LPS组和rhTNFR：Fc＋LPS组。给药后记录各组大鼠死亡情况，测定肺组织湿重／干重比，HE染色观察肺组织病理学改变，检测血清TNF-α含量及其生物活性。结果：LPS注射后大鼠死亡率及肺湿重／干重比显著高于对照组（P〈0．05），HE染色可见大鼠肺间质充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血清TNF-α含量及生物活性增高；rhTNFR：Fc＋LPS组大鼠死亡率降低，肺组织病理损伤明显减轻，血清TNF-α生物活性显著低于LPS组（P〈0．05）。结论：rhTNFR：Fc通过中和TNF-α，降低TNF-α生物活性，有效减轻LPS引起的大鼠急性肺损伤。     

类风湿关节炎患者应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子α受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗过程中并发淋巴瘤

1例81岁男性患者因类风湿关节炎病情加重,皮下注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子α受体-抗体融合蛋白25 mg,2次/周;口服甲氨蝶呤10 mg,1次/周。治疗13个月后发现左下颌下无痛性肿物,切除肿物,病理确诊为腺淋巴瘤。术后停用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子α受体-抗体融合蛋白及甲氨蝶呤,随访8个月淋巴瘤无复发。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗银屑病关节炎的临床疗效和安全性初步研究

目的评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc;商品名:益塞普)联合甲氨蝶呤治疗银屑病关节炎(PsA)患者的临床疗效以及安全性。方法本研究为对照开放性试验,共纳入16例活动期脊柱病型PsA患者,至少服用甲氨蝶呤10～15mg/周联合非甾体抗炎药3个月临床未缓解。试验组加用rhTNFR:Fc每周50mg皮下注射,对照组加用其他改善病情抗风湿药(DMARDs)(来氟米特3例,沙利度胺3例,柳氮磺吡啶2例)。主要评价指标为2,4,8,12周达到强直性脊柱炎(AS)评价标准(ASAS)20改善的比例以及银屑病皮损面积和严重性指数(PSI75),次要评价指标包括上述时间达到ASAS50改善的比例以及PSI50,ASAS评分系统各单项指标的变化。并同时记录2组药物不良反应。计量资料比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验,计数资料比较采用χ2检验。结果第2周对照组所有指标较基线均无明显改善,而试验组均明显改善(P<0.05)。至12周时试验组及对照组达到ASAS20改善的患者数分别为7例(7/8)及2例(2/8),2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。试验组ASAS50、PSI75、PSI50均明显优于对照组。2组均未见严重不良反应发生。结论 rhTNFR:Fc治疗PsA能明显改善脊柱关节症状,减轻皮损,并且具有良好的安全性和耐受性。     

Detection of Sotatercept (ACE‐011) in human serum by SAR‐PAGE and western single blotting

A method for the detection of Sotatercept (ACE‐011, ACVR2A‐Fc) in human serum is presented. The method is a modification of a recently published protocol for Luspatercept (ACE‐536, ACVR2B‐Fc), another erythropoiesis stimulating fusion protein. Out of 27 tested antibodies against either the extracellular domain of ACVR2A or the full‐length protein, only 4 antibodies bound strongly enough to Sotatercept for usage with immunoprecipitation followed by SAR‐PAGE and Western single blotting. The adapted protocol allows the detection of 0.1 ng/mL Sotatercept in just 50 μL human serum. None of the 3 commercial ACVR2‐ELISAs was able to detect Sotatercept and the 2 tested surrogate proteins, even in the μg/mL range. As for Luspatercept, only IPG‐IEF/2D‐PAGE generated discrete isoforms. Due to the long serum half‐life, the SAR‐PAGE method will be able to detect Sotatercept for several weeks and will be very useful in doping testing.     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体–抗体融合蛋白对脂多糖诱导休克大鼠肠损伤的保护作用

观察注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 (rhu TNFR: Fc) 对脂多糖 (LPS) 诱导的休克大鼠肠损伤的保护作用及其可能机制。SD大鼠随机分为对照组、rhu TNFR: Fc组、LPS组和rhu TNFR: Fc + LPS组, 监测各组大鼠平均动脉压 (MAP) 计算其死亡率, 检测血清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 含量和活性; 观察小肠病理形态变化。结果表明, 对照组和rhu TNFR: Fc组大鼠全部存活, MAP无变化, TNF-α含量和活性均维持较低水平; LPS组大鼠死亡率为83%, TNF-α含量和活性明显高于对照组; rhu TNFR: Fc + LPS组大鼠死亡率33%, TNF-α含量升高, 其活性较LPS组明显降低, rhu TNFR: Fc还能降低LPS所致的MDA含量和MPO活性的升高并减轻LPS所致的肠病理性损伤。因此rhu TNFR: Fc对LPS诱导的休克大鼠的肠损伤有保护作用, 其机制可能主要是竞争性结合TNF-α, 减低TNF-α活性以及抗氧化作用。     

重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和标准的研究

目的建立重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和质量标准。方法用中和TNF-α生物学活性的方法测定重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白效价,用胰蛋白酶酶切分析肽图,用ELISA方法分别测定蛋白A、残留宿主细胞蛋白残留量和重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白含量。结果建立了重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的生物学活性、肽图分析、残留蛋白A等质控方法和质量标准。结论建立的方法和质量标准已用于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白产品的检定。