黄芪和雷公藤多甙对大鼠肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-6影响的比较

[目的]观察比较黄芪和雷公藤多甙对’肾小球系膜细胞增殖及其分泌白细胞介素6(IL-6)水平的影响【方法】应用细胞培养技术进行肾小球系膜细胞培养,采用血清药理学方法,制备黄芪舍药血清、雷公藤多甙含药血清．并分为低、中、高3个剂量梯度(5％、10％、20％),观察含药血清对过度增殖状态下肾小球系膜细胞增殖和分泌IL-6的影响．应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定系膜细胞增殖,酶标记免疫吸附分析法(ELISA)测定细胞IL-6含量。【结果】黄芪、雷公藤多甙含药血清各剂量组均可抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖,并能抑制肾小球系膜细胞产生IL-6,其抑制作用呈剂量效应关系,其中尤以雷公藤多甙高、中剂量组及黄芪高剂量组作用显著。【结论】在体外培养的肾小球系膜细胞处于过度增殖的状态下．黄芪能抑制肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-6,其作用与雷公藤相仿,两药合用可减少雷公藤用量,可能具有增效减毒的作用。     

盐酸小檗碱对结肠癌HT29细胞鸟氨酸脱羧酶表达的影响

[目的]观察盐酸小檗碱对结肠癌HT29细胞鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达的影响.[方法]以不同浓度的盐酸小檗碱作用于HT29细胞72 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖抑制,采用荧光定量PCR法及Western blot方法分别检测ODC mRNA及蛋白的表达水平.[结果]盐酸小檗碱可抑制HT29细胞增殖,剂量依赖性地显著下调ODC蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01),但对ODCmRNA表达无显著影响.[结论]盐酸小檗碱具有抑制HT29细胞的增殖作用,其机制可能与下调ODC蛋白表达相关.     

黄芩苷对小鼠巨噬细胞CD36表达及肿瘤坏死因子-α分泌的影响

[目的]观察黄芩苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠巨噬细胞CD36表达及炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌的影响.[方法]分别用LPS(终浓度0.1μg/mL)或LPS加黄芩苷(终浓度分别为50、100 μmol/L)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用实时荧光定量PCR法和流式细胞术检测黄芩苷对巨噬细胞CD36分子表达的影响,然后采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液中TNF-α含量变化.[结果]LPS刺激可以诱导巨噬细胞CD36表达升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);不同浓度黄芩苷预处理组可显著抑制LPS诱导的CD36基因转录和蛋白表达,与LPS组比较差异有统计学意义(P＜0.01);黄芩苷还可显著减少巨噬细胞炎症因子TNF-α的分泌(P＜0.05).[结论]黄芩苷可通过抑制CD36表达,下调LPS诱导的巨噬细胞炎症因子TNF-α的生成从而发挥抗炎作用.     

灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL-1α,IL-2 mRNA表达的拮抗作用

[目的]观察灵芝多糖(GLB)对前列腺素E2(PGE2)抑制小鼠脾细胞增殖及IL-1α、IL-2 mRNA表达的拮抗作用.[方法]采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖程度,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测IL-1α及IL-2 mRNA的表达水平.[结果]PGE2连续作用48 h后,脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用,当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L,并合用不同浓度的GLB(25、50、100、200 mg/L),当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2(20 μmoL/L)的抑制作用(P＜0.05);培养8 h及12 h后,PGE2(20 μmol/L)可抑制IL-1α及IL-2 mRNA的表达,GLB为100 mg/L以上浓度时可部分拮抗PGE2的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01).[结论]灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL-1α和IL-2 mRNA表达的抑制作用.     

黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

【目的】观察黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠MSCs,反复传代及纯化后,取第3代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34和CD44;取第8代MSCs进行分组诱导:黄芪甲苷组(终浓度为250 mg/L)、5-氮胞苷(5-aza,终浓度为10μmol/L)、黄芪甲苷加5-aza组(终浓度分别为250 mg/L与10μmol/L),并设空白对照组,诱导后继续培养4周;计算心肌样细胞诱导率,采用免疫组化法鉴定诱导后MSCs中结蛋白(Desmin)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导后MSCs中心肌特异性蛋白α-心肌肌球蛋白重链(-αMHC)和β-心肌肌球蛋白重链(-βMHC)信使核糖核酸(mRNA)的表达。【结果】原代培养的MSCs首先形成集落,传代细胞体积变大,诱导后细胞呈梭形,并出现肌管;MSCs表面抗原CD44表达阳性,而骨髓造血干细胞表面抗原CD34表达阴性,表明本实验方法所得细胞为均一的MSCs细胞群;各组在不同时间的心肌样细胞诱导率无明显差异;免疫组化结果显示诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白Desmin和cTnI;RT-PCR结果显示诱导后MSCs表达成熟的心肌特异性蛋白-αMHC和-βMHC。【结论】黄芪甲苷可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,但诱导率仍有待提高。     

苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞株增殖的抑制作用及机制研究

【目的】观察苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】以不同浓度苦参碱干预K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞,采用新型四唑氮盐(MTS)做比色分析测定细胞增殖,流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡,细胞划痕法观察细胞侵袭转移能力的变化,Western blotting方法检测细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下游关键激酶MEK1/2蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较,0.125~1 mg/m L浓度的苦参碱能显著抑制SW480细胞增殖,促进细胞凋亡,有效抑制结肠癌细胞的移行,降低MEK1/2蛋白的表达(P0.05),其作用强度随药物浓度增加有升高的趋势。【结论】苦参碱可能通过下调MAPK信号通路下游MEK1/2蛋白的表达,有效抑制SW480细胞的增殖和移行,并促进其凋亡。     

化疗药物对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达TLR2、TLR4的影响

目的 观察氟尿嘧啶和顺铂对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)的影响.方法 用直接免疫荧光流式细胞术检测加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后24、48和72 h HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率.结果 HepG2.2.15细胞上TLR2和TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(P＜0.01),但加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后,HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的MFI及阳性细胞率均基本无变化,仅在100、200 μg/ml的氟尿嘧啶和20μg/ml的顺铂作用72 h后,HepG2.2.15细胞表达TLR2的MFI低于空白对照组(P＜0.05).结论 体外实验显示在肝癌细胞中经典化疗药物氟尿嘧啶和顺铂不能激活TLR2和TLR4信号途径,要通过激活TLR2和TLR4信号途径而达到对抗肝癌细胞的作用,需要寻找其他的方式.     

黄芩苷对溃疡性结肠炎患者细胞因子表达的影响

目的探讨活动期溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）患者外周血中多种细胞因子的变化以及不同浓度的黄芩苷的干预作用。方法应用实时定量PCR法（Q－PCR）检测UC患者外周血单个核细胞IL4R、 IL6R、 IL23R、 RORC的表达,采用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测血清干扰素－γ（IFN－γ）、白细胞介素－4（IL－4）、白细胞介素－5（IL－5）、白细胞介素－6（IL－6）、白细胞介素－10（IL－10）、转化生长因子－β1（TGF－β1）水平及体外黄芩苷干预下上述指标的变化情况。结果通过Q－PCR检测发现UC患者外周血IL4R、 IL6R、 IL23R、 RORC基因表达较肠易激综合征（IBS－D）组和健康对照组均有不同程度的增高,在体外不同浓度的黄芩苷的干预下,均有不同程度的降低,以20μmol／L和40μmol／L对上述指标的降低作用更明显。 ELISA检测血清中细胞因子, UC组IFN－γ、 IL－5、 IL－6与IBS－D组和健康对照组比较均有不同程度的升高,而IL－4、 IL－10及TGF－β较IBS－D组和健康对照组稍降低;20μmol／L和40μmol／L的黄芩苷可引起IFN－γ、IL－5、 IL－6明显降低, IL－4、 IL－10明显升高。结论较高浓度的黄芩苷能够明显抑制RORC、 IL23R的表达,使IFN－γ、IL－5、 IL－6等细胞因子的水平降低和IL－4、 IL－10及TGF－β1水平升高,说明黄芩苷可以调节免疫平衡而缓解溃疡性结肠的炎症反应。     

甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4 mRNA、NF-κB p65表达的影响

【目的】观察甘露消毒丹对温病湿热证大鼠细胞内毒素Toll样受体4(TLR4)mRNA及核因子-κB(NF-κB)p65表达变化的影响,探讨清热化湿方的治疗机制。【方法】将Wistar大鼠随机分为正常组、湿热模型组(高脂 高温高湿 大肠杆菌)、清热化湿组;采用逆转录—聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测肝组织巨噬细胞TLR4 mRNA,免疫组化技术检测肝组织巨噬细胞NF-κB p65表达。【结果】模型组在感染6、12、24 h不同时相点TLR4 mRNA、NF-κB p65表达逐渐增强,且不同时相点之间比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),说明随着病程的发展,湿热模型TLR4 mRNA、NF-κB p65表达逐渐增强。治疗组6、12、24 h不同时相点的TLR4 mRNA表达逐渐减弱,12、24 h时相点治疗组与模型组比较,TLR4mRNA表达显著性减弱(P<0.05或P<0.01),但与正常组比较仍有显著性差异(P<0.01),说明TLR4 mRNA遏制衰减是一个缓慢的过程。而治疗组NF-κB p65激活6、12、24 h各时相点间比较均无显著性差异,与正常组比较亦无显著性差异,但与同时点模型组比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。【结论】甘露消毒丹对温病湿热证大鼠肝巨噬细胞TLR4 mRNA及NF-κB p65表达具有较好的干预调控作用,能中止炎症介质的转录,限制急性炎症反应。     

Nodosin对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌NO及细胞因子的影响

[目的]观察nodosin对脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞NO和炎症细胞因子的影响.[方法]采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定nodosin对体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞增殖的影响;采用LPS刺激RAW264.7细胞使细胞分泌细胞因子,以不同浓度(1.25、2.5、5 mmol/L) nodosin干预,Griess法检测培养上清液中NO水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量. [结果]Nodosin在10 mmol/L内对RAW264.7细胞增殖无显著影响;可呈一定剂量依赖关系地抑制LPS刺激RAW264.7细胞后NO、IL-6、TNF-α的表达,促进IL-10的表达.[结论]Nodosin的抗炎作用与其能抑制炎症细胞因子NO、IL-6、TNF-α表达,促进IL-10的表达有关.     

肾康丸对体外大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响

【目的】观察肾康丸对体外高糖培养的大鼠系膜细胞(MC)增殖、细胞外基质分泌(ECM)和细胞周期的影响。【方法】将16只Wistar雄性大鼠随机分为4组,即正常血清组,开博通组(剂量为5 mg/kg),肾康丸高、低剂量组(剂量分别为2.4、1.2 g/kg),灌服相应药物7 d,分离制备药物血清。将体外高糖(30 mmol/LGlu)培养的MC分为5组:高糖模型组(30 mmol/LGlu),正常血清组(体积分数5%正常血清),开博通组(体积分数5%开博通含药血清)及肾康丸高、低剂量组(体积分数5%肾康丸高、低剂量含药血清),另设低糖模型组(10 mmol/LGlu)。培养72 h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组细胞增殖,双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测上清纤维连接蛋白(FN)含量,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】高糖培养的MC显著性增殖,上清FN含量显著性增加,并出现细胞周期异常,肾康丸能抑制MC增殖,减少FN分泌,并使G0/G1期细胞比例显著性增加,而S期及G2/M期细胞比例减少。【结论】肾康丸可通过调整MC细胞周期异常,进而抑制高糖诱导的MC增殖和ECM分泌。     

骨康对体外培养人成骨细胞OPG及RANKL基因表达的影响

【目的】观察中药骨康含药血清对肾阳虚型骨质疏松症患者成骨细胞细胞因子骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。【方法】取6月龄体质量2.5～3.0 kg的新西兰大耳白兔4只,雌雄各半,随机分为2组(中药骨康组、空白对照组),每组2只;分别灌服骨康煎剂4.2 g.kg-1.d-1,以及等容积生理盐水,连续灌胃共7 d,最后1次灌胃2 h后所有动物进行心脏采血,收集血清备用。分离并传代培养肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞,取第2代,制成2×105/mL的细胞悬液。实验组分别加入低、中、高不同浓度(体积分数5%、10%、20%)的骨康含药血清进行干预,空白对照组仅加培养液,继续培养。48 h后采用Trizol一步法提取总RNA,然后采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测OPG、RANKL mRNA的表达。【结果】骨康低、中、高浓度组OPG mRNA表达量显著上升,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康中浓度组组间分别比较差异均有统计学意义(P<0.05);骨康含药血清以体积分数5%、10%、20%浓度递增时,RANKL mRNA的表达量显著下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康低浓度组组间RANKL mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】骨康可以上调肾阳虚骨质疏松症患者体外培养成骨细胞OPG mRNA的表达,下调RANKL mRNA的表达。     

青藤碱抗炎作用机理研究

【目的】通过观察青藤碱对人环氧化酶(COX)、白介素-1β(IL-1β)基因表达的影响,探讨青藤碱的抗炎作用机理。【方法】分离正常人外周血单核细胞(PBMC),体外加药培养,提取细胞总核糖核酸(RNA),采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察青藤碱对脂多糖(LPS)刺激和非LPS刺激状态下环氧化酶及IL-1β基因表达的影响。【结果】青藤碱对COX-1基因表达无明显影响,对COX-2基因表达仅有轻微的抑制作用,而对IL-1β基因表达的抑制作用较强。【结论】青藤碱可能是通过抑制炎症性细胞因子的产生而发挥其抗炎作用。     

川芎嗪对缺氧大鼠海马神经元凋亡及bcl-2、p53基因表达的影响

【目的】观察川芎嗪对缺氧大鼠海马神经元凋亡及bcl-2、p53基因表达的影响,探讨脑缺血后神经元损伤途径以及川芎嗪的保护作用机制。【方法】采用大鼠海马神经元体外原代培养法复制缺氧模型。海马神经元培养第14天,分为模型对照组及川芎嗪高、中、低剂量组(剂量分别为800、200、50μg/mL),分别持续缺氧1.5 h。采用流式细胞仪定量分析神经细胞凋亡率,原位杂交法检测海马神经元bcl-2、p53 mRNA的表达。【结果】川芎嗪中剂量组在缺氧1.5 h凋亡率与模型对照组及其他剂量组比较均有显著性差异(P<0.05)。对缺氧1.5 h大鼠海马神经元bcl-2、p53 mRNA原位杂交阳性信号进行分析,川芎嗪中剂量组bcl-2、p53 mRNA的表达与其他各组比较均有显著性差异(P<0.05)。【结论】在无血清培养条件下给予缺氧处理证实了凋亡是脑缺血后神经元损伤途径之一。一定剂量范围的川芎嗪具有抑制神经细胞凋亡的作用,而抑制p53基因的过度表达,上调bcl-2基因表达可能是其作用机制之一。     

热毒清的体外抗炎作用机制研究

【目的】探讨中药热毒清注射液抗炎保护功效的分子机制。【方法】体外扩增互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针,利用原位杂交检测体外培养的人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)在大肠杆菌内毒素(LPS)和热毒清分时相作用下,肿瘤坏死因子-α转换酶(tumour necrosis factor-α converting enzyme,TACE)金属蛋白酶区和解整合素区基因转录水平。【结果】HL-60细胞在LPS刺激0~12 h内金属蛋白酶区转录活性增加16.1%,解整合素区转录活性增加76.8%;热毒清能抑制LPS诱导的TACE mRNA的增加(P<0.01)。【结论】热毒清注射液的抗炎作用可能与抑制TACE转录活性有关。     

白花蛇舌草对H22肝癌细胞热休克蛋白70表达的影响

【目的】观察H22肝癌细胞热休克蛋白70(HSP70)表达及清热解毒中药白花蛇舌草对其表达的影响。【方法】以培养的H22肝癌细胞腹腔接种于小鼠使小鼠致瘤,然后将荷瘤小鼠分为模型组、白花蛇舌草组(剂量为25 g/kg)、党参对照组(剂量为25 g/kg)及热休克处理组共4组。采用免疫组化标记法检测各组活体腹水H22肝癌细胞HSP70的表达情况。【结果】白花蛇舌草组及热休克处理组H22肝癌细胞HSP70的表达显著性高于模型组(P<0.05或P<0.01);党参对照组H22肝癌细胞的HSP70表达与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。【结论】白花蛇舌草可能通过诱导H22肝癌细胞HSP70表达,增强其免疫原性而发挥抗肿瘤作用。     

益气除痰方对A549细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

【目的】研究益气除痰方对肺癌A549细胞凋亡的影响及其分子作用机制。【方法】应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测益气除痰方对A549细胞的生长抑制作用,流式细胞术碘化丙啶(PI)单染法测定细胞凋亡率,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法测定用药前后调亡相关基因p53、bcl-2、bax mRNA表达的变化。【结果】益气除痰方含药血清对A549细胞具有生长抑制作用,且具有一定的时间—浓度依赖性;流式细胞术结果显示:益气除痰方含药血清对A549细胞具有显著诱导凋亡的作用,其低、中、高剂量组凋亡率分别为(8.40±1.67)%、(15.80±2.95)%、(27.4±0.96)%(P<0.05);RT-PCR结果显示:益气除痰方可显著上调p53 mRNA、bax mRNA表达,下调bcl-2 mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。【结论】益气除痰方可促使A549细胞凋亡,其机制可能与提高p53表达,下调bcl-2/bax比例有关。     

木犀草素的体外抗炎机制研究

【目的】观察木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)核因子κB(NF-κB)和环氧合酶2(COX-2)表达及NF-κB DNA结合活性的影响,探讨其体外抗炎机制。【方法】以RAW264.7细胞为研究对象,选用对数生长期的细胞,分别设空白对照组,脂多糖(LPS)处理组(模型组),5、15、45μmol/L木犀草素处理组(中药低、中、高剂量组);加入药物30 min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12 h,分别采用酶免疫测定法(EIA)检测木犀草素对RAW264.7细胞前列腺素E2(PGE2)生成的影响;电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NF-κB的DNA结合活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的水平;Western blot法测定RAW264.7细胞中NF-κB和COX-2蛋白的表达。【结果】木犀草素能显著性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞PGE2的生成,降低NF-κB的DNA结合活性;下调LPS诱导的RAW264.7细胞COX-2 mRNA、NF-κB和COX-2蛋白的表达。【结论】木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内NF-κB的表达和DNA结合活性从而下调COX-2的表达有关。     

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

[目的]观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响.[方法]选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用.[结果]山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系.用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强.DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征.彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关.流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高.[结论]山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用.