甲胎蛋白表达缺失的人肝癌HepG2细胞株的构建

目的：建立甲胎蛋白（AFP）表达缺失的HepG2细胞株。方法：选择AFP的RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pll3．7连接,扩增纯化得到所需质粒。鉴定后将质粒用慢病毒包装、纯化得到病毒粗提液,与HepG2细胞共培养,转染后用RT—PCR和Westernblot实验检测细胞AFP的表达情况。结果：RT-PCR和Westernblot实验显示,干扰后HepG2细胞AFP基因和蛋白的表达显著减少。干扰效率达84％。所得细胞株传代后仍仅能检测到微量AFP表达。结论：成功构建稳定的AFP表达接近缺失的HepG2模型细胞株。     

siRNA靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响

背景：肝癌衍生生长因子（HDGF）分离自人肝癌细胞株,其功能特性与多种肿瘤的生长、侵袭、转移和预后相关。目的：观察以小干扰RNA（siRNA）靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响。方法：以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测人肝癌细胞株HepG2HDGFmRNA表达。构建靶向HDGF的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体．转染HepG2细胞．建立稳定表达siRNA-HDGF的HepG2细胞株。蛋白质印迹法检测siRNA—HDGF的干扰效率。MTT实验和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖情况,Boyden小室体外侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果：HepG2细胞中HDGFmRNA表达明显。蛋白质印迹法筛选出的干扰效率为75-3％的HepG2细胞株．生长速度较转染阴性对照载体和未转染载体的细胞显著减慢（P〈0．05）,在软琼脂上形成的集落数减少（9．64±1．62对36．41±1．68和35．50±3．27,P〈0．05）,穿过Boyden小室Matrigel基质胶的细胞数亦显著减少（51．27±6．53对153．80±10．04和154．33±10．23,P〈0．05）。结论：以siRNA靶向抑制HDGF基因能显著抑制人肝癌细胞株的增殖和侵袭力．HDGF可能成为肝癌基因治疗的重要靶标。     

siRNA干扰纤维蛋白原α链基因对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

背景：纤维蛋白原（FG）是由肝细胞合成、分泌的糖蛋白。除凝血和纤溶外,FG在细胞增殖、血管发生、肿瘤的发生、进展和转移中亦发挥重要作用。肝细胞癌患者血浆FG水平显著高于健康人。目的：观察以RNA干扰技术抑制FG仅链（FGA）基因对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建FGAsiRNA干扰质粒,将重组质粒pU6．FGAsiRNA稳定转染入人肝癌细胞株HepG2,同时设置空质粒载体pU6转染组作为对照。以RT－PCR、蛋白质印迹法在mRNA和蛋白质水平验证干扰效果,以CCK－8实验和流式细胞术检测各组HepG2细胞的增殖和凋亡情况。结果：FGAsiRNA转染组HepG2细胞FGAmRNA和蛋白表达明显低于空载体转染组,细胞增殖显著受抑（P〈0．001）,细胞凋亡显著增加（P〈0．001）。结论：RNA干扰技术能有效下调人肝癌细胞的FGA表达,抑制肿瘤细胞生长增殖并促进其凋亡。FGA可能成为肝细胞癌治疗的潜在靶点之一。     

组织蛋白酶-S在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究组织蛋白酶-S（Cat-S）在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达情况,探讨其与肝细胞癌（HCC）发生、发展的关系。方法体外培养高转移人肝癌细胞株MHCC97-H、低转移人肝癌细胞MHCC97-L和正常肝细胞LO2,采用荧光定量PCR技术定量检测其Cat-S mRNA表达水平。结果 Cat-S mRNA在LO2细胞中呈弱表达,MH-CC97-H细胞及MHCC97-L细胞表达均明显高于LO2细胞（P〈0.05）;MHCC97-H细胞表达明显高于MHCC97-L细胞（P〈0.05）。结论 Cat-S在高转移、低转移肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达存在差异性,此可能与肝癌的发生发展有关;Cat-S可作为肝癌诊治的分子靶标。     

siRNA对脂多糖诱导下HepG2细胞caspase-8基因的干扰及对凋亡的影响

目的:研究针对人caspase-8基因mRNA的siRNA(small interfering RNA)表达载体,观察其转染人肝癌细胞HepG2后,细胞caspase-8基因表达的变化,及其对细胞凋亡的影响。方法:采用针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒,由脂质体介导瞬时转染HepG2细胞株,并采用脂多糖(LPS)诱导HepG2细胞凋亡,RT-PCR、Westernblot测定caspase-8表达。结果:针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒能抑制caspase-8mRNA和蛋白表达;转染后HepG2细胞体外生长明显受到抑制。结论:siRNA表达质粒能有效地抑制HepG2细胞中caspase-8的表达,抑制细胞凋亡并促进生长。为进一步探究肝衰竭基因治疗提供了实验依据。     

RNAi对HepG2．2．15细胞HBx基因表达和细胞迁徙的影响

目的探讨HBx基因在肝细胞癌侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hHlneo质粒，构建针对HBx基因的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3，并转染HepG2．2．15细胞，用逆转录聚合酶链反应检测shRNA对HBx基因mRNA表达，用免疫印迹法（western Blot）检测shRNA对HBx蛋白的表达。应用改良Boyden小室法测定细胞迁移情况。结果成功构建shRNA表达载体，其中shRNA载体psiRNA1对HBx基因的抑制作用最强，对HBxmRNA抑制率达82．46％，对HBx蛋白的抑制率为65．59％；与空载体转染细胞比较，HepG2．2．15细胞在psiRNA1转染后24h、72h迁移率显著下降。结论HBx基因可能促进HCC的侵袭转移。     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

靶向mcl-l基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的: 构建靶向髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法: 设计3对针对mcl-1基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNAfi片段的真核表达质粒(shRNAl-3)并行酶切鉴定和测序分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2中,48 h后测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western blot检测mcl-1 mRNA和蛋白表达情况.结果: 重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功.质粒在HepG2细胞中的转染率约为64%.shRNAl-3导入HepG2细胞48 h后.mcl-1,mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(0.61±0.02,0.56±0.02,0.46±0.01 vs 0.97±0.01,0.95±0.00;0.53±0.01.0.48±0.03,0_36±0.01vs0.90±0.03.0.88±0.01,均P<0.01).与shRNAl和shRNA2相比,shRNA3对mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强(52.6%VS 36.3%,42.9%:63.2%vs41.5%,49.6%,均P<0.01).结论: 成功构建并筛选出的靶向mcl-1的shRNA真核表达质粒对肝癌细胞HepG2内的mcl-1表达具有明显抑制作用.     

肝细胞癌在血中微小转移的检测

目的 肝细胞癌患者术后复发常是术前不能检出微转移灶或术中癌细胞释放入血之故。建立早期检出肝细胞癌（HCC）血中微小转移的方法并评价其临床意义。方法 采用巢式RT－PCR检测肝细胞特异白蛋白（ALB）mRNA和甲胎蛋白（AFP）mRNA在HCC患者外周血有核细胞成分及组织标本中的表达情况。并以肝癌细胞系HepG2、SMMC7721,乳腺癌细胞MCF－7作为阳性，阴性对照。结果 在肝组织，无论是癌、癌旁还是正常组织，ALB mRNA的表达均为阳性（8／8），而AFP mRNA在癌组织7／8例表达，癌旁5／8例表达。外周血表达的情况为：同一组标本ALB mRNA的阳性率为75.6%（34／45，P＜0．01），AFPmRNA的阳性率为57．8％（26／45，P＜0．01）。在有肝外转移和无肝转移分组中，ALBmRNA和AFPmRNA的表达分别为100．0％，54．2％和29．2％。结论 在HCC患者外周血有核心细胞成分中检测ALBmRNA和AFPmRNA的表达，是预测转移、复发的简捷手段，若ALB与AFP二者联合使用，应用性会更强。     

短发夹状RNA对人肝癌细胞环氧合酶-2的抑制作用

目的:构建针对人环氧合酶-2(COX-2)基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒,观察其在不同时间点对人不同肝癌细胞株COX-2表达的影响.方法:以人COX-2mRNA编码区作为RNA干扰靶点,构建shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体分别转染人肝癌细胞株HepG2和Bel7402,利用逆转录聚合酶链反应和Westernblot法分别观察两株细胞转染后24,48,72,和96hCOX-2mRNA和蛋白的表达变化,检测抑制效果.结果:质粒在HepG2细胞和Bel7402细胞中的转染率分别约为60%和54%.WBH1导入细胞24,48,72和96h后,逆转录聚合酶链反应检测COX-2mRNA表达抑制率,HepG2细胞分别为18.5%,88.6%,52.8%和42.4%(P<0.01).Bel7402细胞分别为9%,45.1%,70.1%和56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.     

Construction of a targeting adenoviral vector carrying AFP promoter for expressing EGFP gene in AFP-producing hepatocarcinoma cell

AIM:To construct a recombinant adenoviral vector carrying AFP promoter and EGFP gene for specific expression of EGFP gene in AFP producing hepatocellular carcinoma (HCC) HepG2 cells.METHODS: Based on the Adeno-X^TM expression system, the human immediate early cytomegalovirus promoter (PCMV IE)was removed from the plasmid, pshuttle,and replaced by a 0.3 kb (α-fetoprotein (AFP) promoter that was synthesized by polymerase chain reaction (PCR).The enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene was inserted into the multiclone site (MCS),and then the recombinant adenovirus vector carrying the 0.3kb AFP promoter and EGFP gene was constructed.Cells of a normal liver cell line (LO2),a hepatocarcinoma cell line (HepG2) and a cervical cancer cell line (HeLa) were transfected with the adenovirus.Northern blot and fluorescence microscopy were used to detect the expression of the EGFP gene at mRNA or protein level in three different cell lines.RESULTS:The 0.3kb AFP promoter was synthesized through PCR from the human genome.The AFP promoter and EGFP gene were directly inserted into the plasmid pshuttle as confirmed by restriction digestion and DNA sequencing.Northern blot showed that EGFP gene was markedly transcribed in HepG2 cells,but only slightly in LO2 and HeLa cells.In addition,strong green fluorescence was observed in HepG2 cells under a fluorescence microscopy,but fluorescence was very weak in LO2 and HeLa cells.CONCLUSION:Under control of the 0.3kb human AFP promoter, the recombinant adenovirus vector carrying EGFP gene can be specially expressed in AFP-producing HepG2 cells,Therefore,this adenovirus system can be used as a novel,potent and specific tool for gene-targeting therapy for the AFP positive primary hepatocellular carcinoma,     

Construction of a targeting adenoviral vector carrying AFP promoter for expressing EGFP gene in AFP-producing hepatocarcinoma cell

AIM:To construct a recombinant adenoviral vector carryingAFPpromoter and EGFPgene for specific expression of EGFPgene in AFP producing hepatocellular carcinoma (HCC)HepG2 cells.METHODS:Based on the Adeno-X~(TM) expression system,thehuman immediate early cytomegalovirus promoter (P_(CMVIE))was removed from the plasmid,pshuttle,and replaced by a0.3 kb α-fetoprotein (AFP) promoter that was synthesizedby polymerase chain reaction (PCR).The enhanced greenfluorescent protein (EGFP) gene was inserted into the multi-clone site (MCS),and then the recombinant adenovirusvector carrying the 0.3 kb AFP promoter and EGFP genewas constructed.Cells of a normal liver cell line (LO2),ahepatocarcinoma cell line (HepG2) and a cervical cancercell line (HeLa) were transfectecl with the adenovirus.Northern blot and fluorescence microscopy were used todetect the expression of the EGFPgene at mRNA or proteinlevel in three different cell lines.RESULTS:The 0.3 kb AFP promoter was synthesizedthrough PCR from the human genome.The AFP promoterand EGFP gene were directly inserted into the plasmidpshuttle as confirmed by restriction digestion and DNAsequencing.Northern blot showed that EGFP gene wasmarkedly transcribed in HepG2 cells,but only slightly in LO2and HeLa cells.In addition,strong green fluorescence wasobserved in HepG2 cells under a fluorescence microscopy,but fluorescence was very weak in LO2 and HeLa cells.CONCLUSION:Under control of the 0.3 kb human AFPpromoter,the recombinant adenovirus vector carrying EGFPgene can be specially expressed in AFP-producing HepG2cells.Therefore,this adenovirus system can be used as anovel,potent and specific tool for gene-targeting therapyfor the AFP positive primary hepatocellular carcinoma.     

阻断肝再生增强因子表达对HepG2细胞转化生长因子-α及表皮生长因子受体表达的影响

目的用RNA干扰技术阻断人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration,hALR）表达,观察人肝癌细胞HepG2中转化生长因子-α（transforming growth faetor-α,TGF-α）及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达是否受影响,以阐明hALR在促进肝癌细胞生长的相关细胞因子网络中的作用。方法将构建好的人肝再生增强因子siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B分别转染至HepG2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率。免疫细胞化学法检测转染细胞中hALR表达,确定抑制效果。根据转染质粒的不同,将HepG2细胞分为3组：转染组（转染pSIALR-A）、阴性对照组（转染pSIALR-B）和空白组（未转染重组质粒）。放射免疫法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞培养上清中TGF-α水平,Western blot法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞EGFR蛋白的表达。结果转染组、空白组和阴性对照组TGF-α分别为（5.27±0.86）pg／ml、（7.92±2.65）pg／ml和（6.50±1.28）pg／ml,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义（P％0.05）;EGFR相对表达量分别为0.946±0.136、1.115±0.606和1.131±0.509,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论在促进肝癌细胞生长的细胞因子网络中,肝再生增强因子除了可以直接刺激肝癌细胞增殖外还可通过上调TGF-α及EGFR的表达水平参与肝癌的发生、发展。     

人ZEB1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡的影响

目的：探讨ZEB1基因与肝癌的关系,进一步揭示ZEBl基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：利用基因重组技术构建pCI-neo-ZEB1真核表达载体：脂质体介导转染技术转染肝癌细胞系HepG2。采用WesternBlot技术检测重组质粒的转染效率,CCK8比色法测定重组质粒转染对HepG2细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后HepG2细胞凋亡率。结果：重组质粒经Nhel和Xbal双酶切、测序与ZEBl基因序列一致;利用脂质体介导将pCI-neo-ZEB1重组质粒转染HepG2细胞株,经WesternBlot技术检测ZEB1基因在蛋白水平稳定高表达;与对照组比较,人HepG2细胞株转染pCI-neo-ZEB1真核表达载体后细胞增殖能力增强,细胞凋亡率明显降低。结论：成功构建重组质粒Pci-neo-ZEB1并转入肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖能力增强,凋亡减少。     

人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。     

抗增殖蛋白过表达对HepG2细胞增殖和凋亡的影响*

目的 探讨抗增殖蛋白（PHB）过表达对人肝癌细胞系HepG₂细胞增殖和凋亡的影响。方法 在已构建的PHB真核表达质粒pEGFP-N1-PHB瞬时转染HepG₂细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测HepG₂细胞增殖;使用流式细胞仪检测HepG₂细胞周期和凋亡。结果 转染pEGFP-N1-PHB细胞增殖明显低于pEGFP-N1空载转染细胞或未转染细胞（P<0.05）;在转染后48 h,转染组G2/M期细胞比例为（27.84±0.47）%,显著高于空载转染组的（17.21±0.64）%或未转染组的（22.67±0.33）%（P<0.001）;转染组细胞凋亡率为（31.72±0.35）%,显著高于空载转染组的（18.66±0.56）%或未转染组的（13.47±0.94）%（P<0.001）。结论 PHB过表达可抑制人肝癌HepG₂细胞增殖,诱导细胞进入G2/M期后被阻滞,并诱导细胞凋亡。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。