pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体的构建及在大鼠心肌细胞的表达

目的克隆大鼠CYP2J3基因,与pcDNA3.1(+)真核表达质粒载体连接,转染大鼠心肌细胞检测其表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链式反应(OE-PCR)的方法扩增大鼠CYP2J3基因,与双酶切的pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体。转染大鼠心肌细胞,用RT-PCR的方法鉴定其在大鼠心肌细胞的表达。结果得到CYP2J3基因全长序列和真核表达载体pcDNA3.1(+)-CYP2J3。RT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)-CYP2J3后的大鼠心肌细胞CYP2J3基因有稳定表达。结论克隆大鼠CYP2J3基因、pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体构建及在大鼠心肌细胞的表达均获成功,为进一步研究CYP2J3基因在细胞中的功能奠定了基础。     

TINCR靶向microR-544a/FBXW7对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）组织分化诱导非蛋白编码RNA（TINCR）靶向microRNA-544a（miR-544a）/FBXW7对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法 体外培养人乳腺癌MCF7细胞株,设置空白对照组（不转入任何载体）、TINCR NC组（pcDNA3.1空载体）和TINCR上调组（pcDNA3.1-TINCR表达载体）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测MCF7细胞lncRNA TINCR、miR-544a相对表达量;CCK-8法检测MCF7细胞增殖情况;流式细胞术检测MCF7细胞凋亡情况;Transwell法检测MCF7细胞侵袭情况;Western blotting检测MCF7细胞FBXW7、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白相对表达量。取TINCR上调组MCF7细胞,分为miR-544a NC组（转染miR-544a NC）和miR-544a上调组（转染miR-544a mimic）,验证转染效率。结果 空白对照组、TINCR NC组MCF7细胞lncRNA TINCR、miR-544a相对表达量、OD值、细胞凋亡率、穿膜细胞数及FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与空白对照组、TINCR NC组比较,TINCR上调组MCF7细胞lncRNA TINCR相对表达量、细胞凋亡率及FBXW7、Bax蛋白相对表达量升高（P <0.05）,miR-544a相对表达量、OD值、穿膜细胞数及PCNA、MMP-2蛋白相对表达量降低（P <0.05）。TINCR上调组与miR-544a NC组MCF7细胞OD值、侵袭细胞数及miR-544a、FBXW7蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与TINCR上调组和miR-544a NC组比较,miR-544a上调组MCF7细胞OD值、侵袭细胞数及miR-544a相对表达量升高（P <0.05）,FBXW7蛋白相对表达量降低（P <0.05）。结论 lncRNA TINCR可能通过靶向miR-544a/FBXW7,抑制人乳腺癌细胞增殖、侵袭,并促进其凋亡。     

LncRNAHOTAIRM1/HOXA1促进胶质瘤增殖迁移和侵袭

目的 探究长链非编码RNA HOTAIRM1(LncRNA HOTAIRM1)靶向调控HOXA1对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集2020年10月至2021年12月于温州市中心医院接受手术治疗的60例胶质瘤患者的肿瘤组织及癌旁正常脑组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定并比较正常脑组织和胶质瘤组织中HOTAIRM1 mRNA和HOXA1 mRNA表达;构建干扰LncRNA HOTAIRM1的慢病毒载体(sh-HOTAIRM1)及其阴性对照载体(sh-NC)、HOXA1过表达载体(pcDNA3.1-HOXA1)及其阴性对照载体(pcDNA3.1-NC)。培养人胶质瘤细胞LN229并进行转染干预,分为对照组(无转染)、sh-HOTAIRM1组(转染sh-HOTAIRM1)、sh-NC组(转染sh-NC)、sh-HOTAIRM1+HOXA1组(转染sh-HOTAIRM1和pcDNA3.1-HOXA1)、sh-HOTAIRM1+NC组(转染sh-HOTAIRM1和pcDNA3.1-NC)。采用MTT法检测转染后各组细胞增殖能力,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡...     

LncRNA HOTAIR靶向miR-34a-5p调节类风湿关节炎滑膜细胞凋亡的机制研究

目的:研究长链非编码RNA HOX转录反义RNA(LncRNA HOTAIR)对类风湿关节炎滑膜细胞(MH7A)凋亡的调控作用及其作用机制.方法:运用脂质体将pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-HOTAIR组(转染pcDNA-HOTAIR)、antagomiRNA组(转染antagomiRNA)、antagom...     

pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓内皮祖细胞后VEGF165的表达

目的:培养和鉴定大鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),观察pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染大鼠骨髓内皮祖细胞后内皮细胞生长因子165(Vascular endot-helial growth fator-165,VEGF165)的表达.方法:体外培养内皮祖细胞,以免疫细胞化学法检测其表面抗原(CD34、CD133、KDR)的表达.通过pcDNA3.1(+)质粒转染VEGF165后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测内皮祖细胞培养上清液中VEGF蛋白的水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达.结果:免疫细胞化学检测表明培养的细胞为大鼠内皮祖细胞,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576 bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带位于500 bp与600 bp之间,约576bp大小.ELISA检测结果为pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组上清液中VEGF165水平为(175.8±10.7)pg/ml,pcDNA3.1(+)空质粒组为(10.5±1.6)pg/ml,未转染组为(9.3±1.3)pg/ml.结论:内皮祖细胞体外培养有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165载体转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165.     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

大鼠Smac基因的克隆及其在心肌细胞H9C2中的表达

目的：克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法：应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1⁺、pcDNA3.1⁺-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果：经测序目的基因序列与GenBank（NM_001008292）公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1⁺-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1⁺-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性（P>0.05）;转染pcDNA3.1⁺-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性（P<0.01）。结论：克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。     

长链非编码RNA SNHG10对胰腺癌细胞的迁移及侵袭的影响

目的分析长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)小核仁RNA宿主基因10(small nucleolar RNA host gene 10,SNHG10)在胰腺癌(pancreatic cancer, PC)细胞中的表达水平,并观察其对细胞迁移及侵袭能力的影响。方法采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测5株PC细胞(AsPC-1、Capan-1、CFPAC-1、PANC-1和PaCa-2)和正常胰腺导管上皮细胞(HPDE)中SNHG10的表达特征。采用pcDNA3.1(+)-SNHG10载体过表达SNHG10,以pcDNA3.1(+)载体为对照;采用shRNA-SNHG10载体干扰SNHG10表达,以shRNA-control载体为对照。采用细胞划痕和Transwell侵袭试验观察过表达和干扰SNHG10后AsPC-1和PANC-1细胞迁移及侵袭能力的变化。结果 SNHG10在AsPC-1、Capan-1、CFPAC-1、PANC-1和PaCa-2细胞中的表达水平均显著高于HPDE细胞(P0.05),并以AsPC-1和PANC-1细胞的表达水平为最高(P0.05)。转染pcDNA3.1(+)-SNHG10载体可显著提高AsPC-1和PANC-1细胞中SNHG10的表达水平(P0.05),而转染shRNA-SNHG10载体显著抑制AsPC-1和PANC-1细胞中SNHG10的表达水平(P0.05)。转染shRNA-SNHG10载体可显著促进AsPC-1和PANC-1细胞的迁移及侵袭能力(P0.05),而转染shRNANHG10载体显著抑制AsPC-1和PANC-1细胞的迁移及侵袭能力(P0.05)。结论 SNHG10在PC细胞中表达上调。过表达SNHG10可促进PC细胞的迁移及侵袭能力,而干扰SNHG10可抑制PC细胞的迁移及侵袭能力。     

NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的构建大鼠NELL2基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NELL2的microRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应。方法从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的片段克隆至表达载体pcDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2。针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4)。将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组),采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染pcDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组。结果酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)...     

人LncRNA MIR31HG基因稳定转染PC9细胞系的构建及其对细胞增殖和迁移的影响

目的：检测过表达人MIR31HG基因对PC9细胞增殖和迁移的影响,阐明促癌基因MIR31HG的作用机制。方法：通过RT-PCR法扩增长链非编码RNA（LncRNA）MIR31HG全长序列,分子克隆至pcDNA3.1（-）真核表达载体,将pcDNA3.1-MIR31HG过表达质粒和对照质粒pcDNA3.1分别转染人肺癌PC9细胞。采用酶切鉴定法检测MIR31HG过表达载体的构建情况。通过G418药物筛选建立稳定过表达MIR31HG的PC9细胞系（PC9-pcDNA3.1-MIR31HG,稳定转染组）和对照细胞系（PC9-pcDNA3.1,空载体组）。采用RT-PCR法检测稳定转染细胞系中MIR31HG基因表达水平,采用CCK-8法和划痕愈合实验检测PC9细胞增殖活性和迁移能力。结果：琼脂糖凝胶电泳,成功扩增得到了MIR31HG的特异基因片段;MIR31HG真核表达载体经双酶切后分别产生目的基因和载体2个片段。RT-PCR法检测,稳定转染组细胞中MIR31HG mRNA表达水平明显高于空载体组（P<0.05）。CCK-8检测,在培养24、36和48h时,稳定转染组细胞增殖活性明显高于空载体组（P<0.01）。划痕愈合实验,在培养48h时,稳定转染组细胞划痕愈合率明显高于空载体组（P<0.05）。结论：成功构建了人LncRNA MIR31HG基因的真核过表达载体和过表达MIR31HG的稳定转染PC9细胞系,且MIR31HG过表达能够促进肺癌PC9细胞增殖和迁移。     

LncRNA SNHG17通过miR-384靶向AEG1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的调控作用

目的：研究长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因17 (lncRNA SNHG17）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞生物学行为的影响,并阐明其作用机制。方法：培养人NSCLC A549细胞和H1299细胞,细胞按照分组要求分别转染pcDNA3.1-NC、SNHG17过表达质粒（pcDNA3.1-SNHG17）、si-NC、SNHG17小干扰RNA (si-SNHG17）、mimics NC、微小RNA-384模拟物（miR-384mimics）、inhibitor NC、miR-384抑制剂（miR-384 inhibitor）、pcDNA3.1-星形细胞上调基因1(AEG1）和si-AEG1。实时荧光定量PCR (RT-qPCR）法检测A549细胞和H1299细胞及各组转染后细胞中lncRNA SNHG17、miR-384和AEG1 mRNA表达水平;ENCORI和TargetScan数据库预测lncRNA SNHG17与miR-384、miR-384与AEG1 mRNA之间的靶向结合作用。A549细胞分为si-NC组、si-SNHG17组、inhibitor NC组、miR-384 ...     

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白L23（RPL23）编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR，以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系。方法 按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列。PCR产物经DNA序列测定证实后，通过双酶切，将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )K ，酶切电泳鉴定。采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1( )-RPL23转染SGC7901细胞，pcDNA3.1（＋）－anRPL23转染SGC7901／VCR细胞，经G418筛选后，随机挑选细胞克隆。通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23 mRNA表达水平的变化。结果 应用RT－PCR反应扩增获得大小约0.5kb的特异性片段。经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致。重组正义真核表达载体pcDNA3.1( )-RPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段；重组反义真核表达载体pcDNA3.1( )-anRPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段，均与预期结果相符。转染细胞经筛选后，随机挑选，扩增了2个细胞克隆，斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降，而正义转染后其表达水平明显增加。结论 成功克隆了人RPL23编码基因序列，并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中得到稳定转染细胞株，正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

大鼠心肌细胞钙调磷酸酶Aβ基因的克隆与真核表达

目的 从原代培养的大鼠心肌细胞中扩增钙调磷酸酶( Calcineurin,CaN)Aβ cDNA序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CaN,并检测其表达情况,为进一步研究CaN及其在心肌损伤的信号转导途径中的作用奠定基础.方法 用RT-PCR方法从原代培养的大鼠心肌细胞RNA中扩增出CaN A β cDNA序列,测序后将其用限制性内切酶双酶切,然后与真核表达质粒pcDNA3.1(+)进行连接,再转化DH5α,将鉴定为阳性的真核表达质粒转染人胚肾293T细胞,用免疫荧光细胞化学技术检测其表达情况.结果 ①将鉴定为阳性的质粒进行测序后,所测序列结果与GeneBank的CaNAβ基因序列同源性达到91.7%;②真核表达载体pcDNA3.1-CaN转染293T细胞后经免疫荧光细胞化学染色检测到钙调磷酸酶基因在人胚肾293T细胞中表达.结论 正确克隆出了大鼠心肌细胞CaNAβ基因并建立了CaNAβ基因的真核表达栽体pcDNA3.1-CaN.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在大鼠腹膜间皮细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素氧合酶-1(HO-1)真核表达载体,并以该重组表达载体体外转染培养的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs).方法 从SD大鼠脾脏中提取总RNA,并经RT-PCR扩增HO-1基因的CDS区全长片段,将PCR产物克隆至pMD-18T载体,BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后获取HO-1片段,用T4DNA连接酶将HO-1片段与双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建大鼠HO-1真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1.酶切鉴定和测序验证后,利用脂质体介导将重组质粒转染原代培养的RPMCs,通过RT-PCR和Western blotting检测RPMCs中HO-1的表达.结果 成功克隆了大鼠HO-1基因并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1,酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中,并经DNA测序验证.pcDNA3.1(-)-HO-1转染RPMCs后,经RT-PCR和Western blotting检测,HO-1在RPMCs中获得高效表达.结论 HO-1基因真核表达载体的成功构建以及HO-1在RPMCs中的高效表达,为进一步研究HO-1在腹膜透析所致RPMCs损伤中的作用奠定了基础.     

NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体peDNA3.1(-)-NELL2的mieroRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应.方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的 片段克隆至表达载体peDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2.针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4).将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组).采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染peDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组.结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确.Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒.证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应.     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

长链非编码RNA，PTENP1通过miR-3611/PTEN基因途径调控宫颈癌进程的分子机制研究

目的 探讨长链非编码RNA PTENP1（以下简称“PTENP1”）在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法 选取2019年1月至2022年12月海南省妇女儿童医学中心诊断的54例的癌组织与癌旁组织,另选取宫颈癌细胞系（HeLa、SiHa、C33A、Caski）和正常宫颈上皮细胞系（H8）,采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法检测PTENP1、miR-3611、PTEN基因、PTEN蛋白水平。选取合适的宫颈癌细胞系,比较PTENP1在细胞质和细胞核中的表达情况,并进一步将其分为空白组（无处理）、pcDNA3.1组（转染pcDNA3.1）、pcDNA3.1-PTENP1组（转染pcDNA3.1-PTENP1）、NC组（阴性对照,转染模拟物或抑制剂NC）、miR-3611抑制剂组（转染miR-3611 抑制剂）、pcDNA3.1-PTENP1+NC组（转染pcDNA3.1-PTENP1和NC）和pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics组（转染pcDNA3.1-PTENP1和miR-3611模拟物）。比较空白组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PTENP1组PTENP1、miR-3611、PTEN基因、PTEN蛋白及上皮间质转化的相关指标,采用细胞活力检测及流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况;比较空白组、NC组、miR-3611抑制剂组miR-3611、PTEN基因、PTENP1水平;比较pcDNA3.1-PTENP1+NC组和pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics组的细胞增殖情况及上皮间质转化的相关指标。采用双萤光素酶报告基因及RNA下拉实验验证miR-3611与PTENP1、PTEN基因的靶向关系。 结果 癌组织PTENP1、PTEN基因、PTEN蛋白水平低于癌旁组织,miR-3611水平高于癌旁组织（P＜0.05）。HeLa、SiHa、C33A、Caski细胞PTENP1、PTEN基因、PTEN蛋白水平低于H8细胞,miR-3611水平高于H8细胞（P＜0.05）,后续实验选择HeLa、Caski细胞进行,PTENP1在HeLa、Caski细胞质中高表达。pcDNA3.1-PTENP1组PTENP1、凋亡率、上皮钙黏素、PTEN基因高于空白组,细胞增殖活力（培养48、72、96 h）及ZEB1、Snail、波性蛋白、miR-3611低于空白组（P＜0.05）。miR-3611抑制剂组miR-3611低于空白组,PTEN基因、PTENP1高于空白组（P＜0.05）。pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics组细胞增殖活力（培养48、72、96 h）、上皮钙黏素低于pcDNA3.1-PTENP1+NC组,ZEB1、Snail、波性蛋白高于pcDNA3.1-PTENP1+NC组（P＜0.05）。野生型miR-3611转染生物素标记的HeLa、Caski细胞的PTENP1水平高于转染生物素标记的空白细胞和突变型miR-3611转染生物素标记的细胞,分别转染PTENP1或PTEN野生型和miR-3611模拟物的293T细胞的相对萤光活性低于仅转染PTENP1或PTEN野生型的293T细胞（P＜0.05）。结论 PTENP1通过竞争性结合miR-3611调控PTEN表达影响宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。