PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的 探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法 选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23SrRNA基因作为鉴别靶基因，采用通用引物PCR（UP-PCR）进行扩增，并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）和单链构象多态性分析（SSCP）。结果 针对23SrRNA基因片段的Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示，14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大，有利于进行细菌鉴定。结论 运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。     

运用23S rDNA芯片技术进行食源性感染常见致病菌的快速鉴定

[目的]应用23S rDNA芯片技术，建立食源性感染常见致病菌的快速鉴定方法。[方法]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体，合成寡核苷酸探针，点样于载体制成寡核苷酸芯片，对食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。[结果]获得扩增食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段的特异性引物，并在同一条件下扩增出14种细菌目标片段。在均一的杂交条件下与寡核苷酸芯片杂交，用地高辛酶联免疫法进行显色。结果表明，10种细菌杂交结果显示很好的灵敏度和特异性，4种细菌由于探针因素或杂交条件不合适未能显示预期的种(属)杂交结果。对于食源性感染模拟标本，本方法也可以获得预期的结果。[结论]建立的23S rDNA芯片技术在食源性感染常见致病菌鉴定上快速准确的优点，为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。     

沙眼衣原体60kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 克隆和表达沙眼衣原体60kDa外膜蛋白(Omp2)基因。方法 D型沙眼衣原体感染McCoy细胞后，抽提基因组DNA，经PCR扩增出omp2基因片段，与pUCm—T克隆载体连接，酶切纯化后克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达载体pQE30／omp2，PCR、酶切及测序鉴定。IPFG诱导表达，SDS—PAGE检测有无蛋白的表达。结果 (1)获得长约1650bp的PCR产物，酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了omp2基因，序列分析结果与已知omp2序列相同；(2)SDS—PACE检测表达产物，在相对分子量60kDa处有表达条带；(3)诱导表达之菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在。结论 获得了Ct omp2基因片段，并在E．coli M15中成功表达。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

HSP65基因PCR-限制性片断长度多态性分析毛细管电泳技术鉴定分枝杆菌的初步研究

目的　建立HSP6 5PCR RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法。方法　采用PCR扩增分枝杆菌 6 5 kDa热休克蛋白 (HSP6 5 )基因的一个约 4 4 0bp片段 ,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后 ,用毛细管电泳 激光诱导荧光检测酶切片段。结果　试验的全部 7种分枝杆菌都有各自独特的酶切图谱模式 ,几乎所有酶切片段都能很好地分离。结论　该方法用于分枝杆菌种水平的鉴定具有准确度、分辨率和灵敏度高的优点。     

寡核苷酸芯片技术检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌的研究

目的：建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌的快速检测方法。方法：选带正电荷的尼龙膜作为寡核苷酸芯片载体，采用寡核苷酸芯片技术对肠杆菌科食源性感染常见致病菌进行检测和鉴定。结果：在同一条件下运用多重PCR扩增出14种（属）细菌的16SrRNA、23SrRNA基因片段，随后应用寡核苷酸芯片技术对致病菌进行检测得到了相应的特异性杂交图谱。结论：建立的寡核苷酸芯片技术可快速检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌，为食源性感染的快速诊断与预防奠定了良好的基础。     

福氏志贺菌ipaC基因的克隆及序列分析

目的：构建福氏志贺菌毒力蛋白基因（ipaC）重组表达质粒。方法：根据ipaC已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从福氏志贺菌毒力质粒上扩增出ipaC基因片段，克隆到原核表达质粒pET32a中，转化大肠埃希菌TG1感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果：ipaC基因体外扩增产物大小约为1112bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了福氏志贺菌ipaC基因，为下一步细菌性痢疾发病机制的研究奠定基础。     

霍乱弧菌O1和O139血清型I类整合子的扩增与分布研究

目的扩增霍乱弧菌不同血清型I类整合子基因片段,并分析I类整合子在霍乱弧菌O1和O139血清型中的分布. 方法收集霍乱弧菌O1和O139血清型40株,根据GenBank资料设计PCR引物,扩增霍乱弧菌I类整合子基因片段,并用限制性酶切分析法进行鉴定,分析I类整合子在不同血清型的分布情况. 结果从霍乱弧菌O1和O139血清型中均能扩增约800 bp的基因片段,扩增片段经Pst I酶切后可获得671和127 bp的片段,经HindIII酶切后可获得580、160和58 bp的片段,经HindIII 和Pst I酶切后可获得453、160、127和58 bp的片段,I类整合子在O139血清型霍乱弧菌中分布多于O1血清型. 结论 I类整合子与霍乱散发菌株耐药性的传递、血清型的分布有密切的联系.     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段，克隆到原核表达质粒pQE30中，转化大肠埃希菌M15感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因，为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础：     

金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因的序列分析

目的：构建金黄色葡萄球菌肠素D（SED）毒力蛋白基因重组表达质粒。方法 根据SED已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从金黄色葡萄球毒力质粒上扩增出基因片段，克隆到原核表达质粒PET32中，转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 PCR扩增产物大小为317bp；重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明已正确重组，测序结果与已知序列基本吻合，结论 国内首次克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因，为下一步研究发病机制奠定基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因的构建

目的构建小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因。方法 PCR扩增小鼠IL-10启动子序列,将其插入荧光素酶报告基因pGL3-basic,酶切鉴定及测序比对。结果重组体双酶切电泳后出现大小约4 800 bp与682 bp的两个片段,测序结果显示克隆的小鼠IL-10启动子序列与Genbank中的一致。结论成功构建小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因pGL3-IL10,为进一步研究IL-10奠定了基础。     

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHⅠ和ClaⅠ酶切位点的hEPO基因引物，采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段，亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Tbp10，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

人乳头瘤病毒11型L1 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-L1基因,将L1基因经双酶切后克隆到pcDNA3 1(+)中,测序鉴定。结果:从病变组织中扩增出了全长HPV11-L1基因,并正向插入表达载体pcDNA3 1(+)中,转化JM109扩增后经酶切和测序鉴定,证实克隆成功。结论:HPV11-L1DNA疫苗质粒的构建为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础。     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。