降钙素基因相关肽对大鼠血管平滑肌细胞增殖及表型转化的影响

目的:探讨降钙基因相关肽(CGRP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及表型转化的影响,并对VSMC增殖模型的应用价值作出评估。方法:取大鼠主动脉,分成CGRP作用和无CGRP作用2个实验组,体外培养8d,收集血管前24h用BrdU标记。H-E染色和5-BrdU免疫细胞化学染色观察增殖变化;RT-PCR检测高血压相关基因1(HRG-1)和SM22α基因表达。结果:血管中膜可见大量棕黄色标记增殖的细胞核,VSMC明显增生,HRG-1和SM22α mRNA表达明显减少;而加入CGRP共培养组标记的增殖细胞大大减少,也未见有斑块增生,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调。结论:CGRP对VSMC增殖有抑制作用并可使VSMC从合成型向收缩型转化。     

降钙素基因相关肽对血管平滑肌表型转化和增殖的影响

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化和增殖的影响以及它们之间的关系.方法 取大鼠主动脉先体外培养8d后再贴块培养(VSMCs);对照组直接用贴块法培养细胞.实验分为CGRP作用组和无CGRP作用组.用5-BrdU标记平滑肌细胞增殖变化;RT-PCR检测HRG-1和SM22α表达变化.结果 血管经体外培养8d后再贴壁培养的平滑肌细胞可见大量棕黄色标记增殖的细胞核,HRG-1和SM22α mRNA表达明显减少;而CGRP作用组标记的血管平滑肌增殖细胞明显减少,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调.结论 CGRP对VSMCs增殖有抑制作用并同时可使VSMCs从合成型向收缩型转化.     

人参皂苷Rg1抑制脂多糖诱导BV-2小胶质细胞增殖

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的调控作用及其对活化的BV-2小胶质细胞增殖的调控作用。方法体外培养BV-2小胶质细胞并分为空白对照组、LPS不同时间(1,3,6,8,12 h)处理组及Rg1不同浓度(10、20和50μmol/L)预处理组。采用Western blotting检测细胞增殖相关因子PCNA蛋白和cyclin D1蛋白的表达变化;RT-PCR检测细胞增殖相关因子PCNA和cyclin D1 mRNA的表达变化;免疫荧光染色法观察细胞内cyclin D1蛋白表达变化。采用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 LPS诱导BV-2小胶质细胞PCNA和cyclin D1mRNA和蛋白表达上调,并呈时间依赖性;不同浓度Rg1预处理下调LPS诱导的BV-2小胶质细胞PCNA和cyclin D1的mRNA和蛋白表达。结论Rg1通过下调LPS诱导的BV-2小胶质细胞PCNA和cyclin D1的表达水平来调控细胞周期进而抑制活化的小胶质细胞的增殖。     

17-AAG阻滞HCT-15细胞周期并诱导其凋亡

目的:观察17-AAG对人结直肠癌HCT-15细胞株凋亡和周期及相关分子机制的影响。方法:体外培养HCT-15细胞,分别给予不同剂量的17-AAG及不同作用时间,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞的活力;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期的变化;RTPCR和Western blotting法检测凋亡和周期相关因子的表达水平。结果:1.25~20 mg/L浓度的17-AAG作用24 h和48 h后对HCT-15细胞有显著抑制作用,且有明显的时间、剂量依赖性;0.425、0.85和1.7 mg/L浓度的17-AAG作用48 h后,各组细胞发生G1期阻滞及明显凋亡,STAT3 mRNA和蛋白的表达水平明显下降,凋亡和周期相关因子cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平下调,Cyt C、caspase 9及caspase 3 mRNA和蛋白表达水平上调。结论:17-AAG对人结直肠癌细胞的活力具有明显抑制作用,使细胞周期发生G1期阻滞和细胞凋亡。17-AAG可能通过阻断STAT3通路下调cyclin D1而发生G1期阻滞;17-AAG可能通过阻断STAT3通路启动线粒体凋亡通路来诱导细胞凋亡。     

大鼠血管平滑肌增殖器官模型的建立及其机制探讨

为更好地研究血管平滑肌细胞增生性疾病的机理及防治,建立一种体外VSMC增殖器官模型,并对其机制作初步探讨.HE染色和免疫组化染色显示,大鼠主动脉段在体外拉伤内皮并经20%血清培养后,会出现中膜VSMCs的增殖.体外培养5 d后血管壁VSMC就出现不同程度增生,其中13 d的血管有明显斑块形成;免疫组织化学染色见有标记的增生VSMCs; RT-PCR检测显示,Hrg-1和SM22αmRNA的表达随培养天数增多而减少,至13 d检测不出.而在同样体外培养10 d情况下,与对照组相比,内皮损伤组培养上清中ET-1明显增多,Hrg-1、SM22a mRNA表达下调,Brdu标记增殖细胞增多,当加入内皮素受体阻断剂BQ123后标记细胞明显减少,其中血清培养组与无血清培养组相比,以上检测变化有显著性差异.结果表明,大鼠主动脉经体外培养能诱导平滑肌细胞异常增生并且表型从收缩型向合成型转化, ET-1和血清作用是该模型平滑肌增殖的主要因素.本模型为研究血管平滑肌增殖性疾病的机理和防治提供了一个较好的实验平台.     

干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响

目的: 观察干扰素诱导蛋白p204对鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及p21表达的影响,探讨p204在VSMCs增殖调控中的作用及可能机制。方法: 应用干扰素 α(IFN-α)处理和p204基因( Ifi204 )的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR 法和Western blotting 分别检测p204和p21的mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,降低VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴p21 mRNA和蛋白表达上调。转染 Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与激活p21表达有关。     

中电导钙激活钾通道调节表皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞体外增殖

目的观察表皮生长因子(EGF)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)离子通道中电导钙激活钾通道(KCa 3.1)表达的影响,以及KCa 3.1在EGF诱导HUVECs体外增殖过程中的作用。方法 MTT法筛选EGF最佳实验浓度;免疫荧光和Western blotting技术检测EGF对HUVECs细胞KCa 3.1的表达;经KCa 3.1阻断剂TRAM-34处理,MTT法分析EGF诱导的HUVECs增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期,RT-PCR法分析细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)表达的水平。结果 EGF处理细胞48h后,MTT实验证实25μg/L浓度的EGF促细胞增殖效应最强。免疫荧光染色显示,EGF明显促进KCa 3.1蛋白表达,且Western blotting提示KCa 3.1的表达上调1.4倍。进一步研究显示,高选择性阻断剂TRAM-34阻断KCa 3.1通道48h后EGF的促细胞增殖作用显著下降,并呈时间和剂量依赖性;细胞周期G1期细胞百分比明显增加;CDK4的mRNA表达下调,而cyclin D1表达无明显变化。结论 KCa 3.1可能通过影响细胞周期进程调节EGF诱导的HUVECs增殖过程。     

17-烯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素对人绒毛膜癌JAR细胞系细胞周期和凋亡的影响及其相关机制

目的 探讨热休克蛋白 90（HSP90）抑制剂17-烯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-AAG）对人绒毛膜癌JAR细胞系细胞周期和凋亡的影响及其相关机制。 方法 体外培养人绒毛膜癌JAR细胞系,经不同浓度的17-AAG作用24 h后,采用TUNEL细胞凋亡法及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR法和Western blotting法检测血管内皮生长因子（VEGF）、cyclinD1、cyclinA1和 Caspase-3在mRNA和蛋白水平的表达情况。 结果 17-AAG对JAR细胞生长具有明显的抑制作用,并存在浓度依赖性。各组细胞发生G₂期阻滞及明显凋亡;5、10、20 mg/L 17-AAG 作用24 h 后,各组细胞增殖相关基因cyclinD1 mRNA及蛋白表达水平相对于0 mg/L 17-AAG处理组（对照组）均下调,VEGF蛋白表达水平相对于0 mg/L 17-AAG处理组（对照组）下调,且下调程度与处理浓度成正比,而凋亡相关基因Caspase-3的mRNA未出现明显上调,但其在蛋白表达水平上调。 结论 17-AAG能够抑制JAR细胞增殖活力,诱导细胞凋亡,17-AAG 可能通过下调VEGF 的表达,产生抗肿瘤血管新生作用;可能通过下调cyclinD1使细胞周期发生G₂期阻滞;且可能通过上调Caspase-3诱导细胞凋亡。     

Notch1表达下调抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导其凋亡

目的探讨慢病毒介导的Notch1表达下调对病理瘢痕成纤维细胞(PSF)中caspase-9活化水平及线粒体膜电位的影响。方法分离培养增生性PSFs,感染Notch1 siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒。分别采用RT-qPCR和Western blot检测细胞中Notch1mRNA和蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;PI单染法检测细胞周期;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)、活化的caspase-3(c-caspase-3)和caspase-9(c-caspase-9)蛋白及胞质和线粒体中细胞色素C(cytochrome C)蛋白;JC-1法检测细胞线粒体膜电位。结果Notch1 siRNA慢病毒感染后的PSFs中Notch1表达水平明显低于阴性对照慢病毒和未感染的PSFs的表达水平(P<0.05)。下调Notch1后的PSFs增殖能力降低(P<0.05);细胞G0/G1期比例升高(P<0.05);细胞凋亡率升高(P<0.05);c-caspase-3和c-caspase-9蛋白表达升高(P<0.05);细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05);细胞中cyclin D1和CDK4蛋白水平降低(P<0.05);胞质内的cytochrome C蛋白含量升高(P<0.05)及线粒体中cytochrome C蛋白水平降低(P<0.05)。结论Notch1表达下调抑制PSFs增殖并诱导凋亡。     

周期蛋白E促进结直肠癌SW1116细胞增殖和侵袭

目的 探究周期蛋白E高表达对结直肠癌SW1116细胞增殖和侵袭的影响。方法 将SW116细胞分为周期蛋白E-过表达组、对照组与空载体组，免疫组化法检测各组细胞周期蛋白E的表达；实时定量PCR法检测周期蛋白E mRNA的表达；四甲基偶氮唑盐实验法(MTT)观察细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期；Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 与对照组与空载体组相比，周期蛋白E过表达组SW116细胞的周期蛋白E mRNA表达明显升高；在24h和48h时的细胞存活率明显升高；G₀/G₁期细胞比例明显升高，G₂/M期细胞比例明显降低；穿膜细胞数明显增加。结论 周期蛋白E促进结直肠癌SW1116细胞的增殖与侵袭。     

MicroRNA-365 Inhibits Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation through Targeting Cyclin D1

MicroRNA-365 (miR-365) plays crucial roles in regulating cell proliferation, apoptosis and differentiation in various cell types. However, its function in vascular smooth muscle cells (VSMCs) is largely unknown. In our study, we found miR-365 was highly expressed in adult rat carotid arteries, but was significantly decreased in rat carotid arteries after balloon injury, a process involving neointima formation and VSMC proliferation. In vitro, the miR-365 significantly inhibited cell proliferation of isolated primary rat aortic VSMCs. Furthermore, we identified that cyclin D1 was a direct target of miR-365 in VSMCs. The miR-365 suppressed cyclin D1 expression on both mRNA and protein level. Luciferase reporter assay demonstrated that miR-365 inhibited cyclin D1 through targeting its 3''UTR. Importantly, cyclin D1 overexpression rescued the inhibitory effect of miR-365 on VSMCs proliferation. Taken together, by our studies, we identified a new MicroRNA, miR-365, involving in the pathological process of vascular injury, which inhibits VSMC proliferation through targeting cyclinD1.     

Apelin-13刺激大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的研究G蛋白耦联受体APJ的内源性配体多肽apelin-13对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其与ERK1/2信号通路的关系。方法采用噻唑蓝比色法(MTT)、Western blot等方法观察apelin-13对体外培养大鼠VSMCs增殖的影响及细胞周期蛋白表达的变化。结果Apelin-13浓度依赖性促进VSMCs增殖,且cyclin D1表达增加;ERK1/2阻断剂PD98059可明显抑制apelin-13诱导的细胞增殖及pERK1/2、cyclin D1表达。结论Apelin-13能促进大鼠VSMCs增殖,其机制可能与apelin/APJ-ERK1/2-cyclin D1信号通路有关。     

IL-32γ对大鼠血管平滑肌细胞增殖与细胞周期的影响

目的: 观察白细胞介素-32γ(IL-32γ)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖与细胞周期的影响及机制。方法: 采用组织贴块法体外培养大鼠VSMCs并以IL-32γ处理。应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;免疫印迹方法检测cyclin D1和核内NF-κB p65蛋白含量;免疫细胞化学染色法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达的变化。结果: 不同浓度(10~50 μg/L)的IL-32γ在24~48 h范围内,浓度和时间依赖性促进VSMCs增殖;50 μg/L的IL-32γ作用VSMCs 24 h后促进了细胞周期由G₁期向S期,进而G₂/M期转化,同时上调NF-κB p65、cyclin D1和PCNA蛋白的表达水平;应用NF-κB抑制剂PDTC能逆转上述效应。结论: IL-32γ能促进大鼠VSMCs增殖和加速细胞周期转化。上调NF-κB p65和cyclin D1的表达可能是其作用机制之一。     

降钙素基因相关肽对内皮细胞细胞间黏附分子1、NOS和组织金属蛋白酶抑制剂2表达的影响

目的：探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对内皮细胞的保护作用机制。方法：用 CGRP 分别作用于培养的正常内皮细胞和经联胺诱导的内皮细胞后,收集细胞用免疫细胞化学和 RT-PCR 方法检测细胞间黏附分子1 (ICAM-1)、一氧化氮合酶(NOS)和组织金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达。结果：联胺诱导的内皮细胞可使 ICAM-1的表达增强,而使 NOS 和 TIMP-2的表达下降。当 CGRP 作用于正常内皮细胞和联胺诱导后的内皮细胞,对 ICAM-1的表达有明显的下调作用,对 NOS 和 TIMP-2的表达则有明显的上调作用。结论：CGRP 对内皮细胞的保护调节作用可通过下调 ICAM-1和上调 NOS 和 TIMP-2的表达来实现,提示 CGRP 在动脉粥样硬化防治方面可能发挥重要作用。     

Src/Stat3通路在高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移中的作用

目的:探讨Src酪氨酸激酶(Src)/信号转导子和转录激活子3(Stat3)在高糖(HG)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移中的作用。方法:首先将VSMC细胞株A7R5与HG(10~40 mmol/L)共同孵育24h,MTT法及EdU染色检测VSMCs增殖,Transwell小室检测VSMCs迁移,Western blot检测p-Src、Src、p-Stat3和Stat3的蛋白水平。q PCR检测Stat3靶基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Myc、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。为了进一步证实Src在高糖诱导VSMCs增殖和迁移中的作用,将HG与Src抑制剂saracatinib(100 nmol/L)共同孵育24 h,观察Src对HG诱导VSMCs增殖、迁移及Stat3激活的影响。结果:HG能浓度依赖性地促进VSMCs的增殖及迁移并激活Src和Stat3,上调Stat3靶基因cyclin D1、Myc、MMP2及MMP9的表达。抑制Src激活可抑制HG诱导的VSMCs增殖及Stat3的激活,同时下调cyclin D1及Myc的表达。结论:Src/Stat3通路可能在HG诱导的VSMCs增殖及迁移中发挥重要作用。     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

Ikaros的3种亚型对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:探讨Ikaros的3种亚型对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。方法:利用逆转录病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞,分别表达Ikaros的3种亚型(IK1、IK2和IK6);采用CCK-8法分析表达不同亚型后SKOV3细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期的改变;Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:CCK-8结果显示IK1和IK2能明显抑制SKOV3细胞的增殖;细胞周期结果表明IK1和IK2能诱导SKOV3细胞发生G1期阻滞,IK6则对SKOV3细胞的增殖能力和细胞周期则无明显影响;Western blot检测结果显示,IK1和IK2明显降低cyclin D1和cyclin D2蛋白的表达水平,同时升高p21蛋白的表达水平。IK6则对SKOV3细胞的cyclin D1、cyclin D2及p21蛋白表达水平无明显改变。结论:IK1和IK2这2种亚型能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,其机制可能是由于IK1和IK2能降低细胞周期促进蛋白cyclin D1和cyclin D2的表达及增加细胞周期抑制蛋白p21的表达,从而诱导细胞周期发生G1期阻滞。而IK6亚型对SKOV3细胞增殖能力及细胞周期无明显影响。     

PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖及Ca2+水平的影响

目的： 研究PAR-2激动剂对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞内Ca2+浓度（［Ca2+］c）的影响。方法: 培养人肝癌细胞HepG2, 分别利用PAR-2激动剂SLIGKV-NH2及反PAR-2激动肽VKGILS-NH2干预肝癌细胞生长,用Fura-2荧光法测定肝癌细胞内［Ca2+］c,用MTT法检测对肝癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术（FCM）检测细胞周期改变情况,RT-PCR法检测cyclinD1 mRNA表达变化。结果: 50 μmol/L SLIGKV-NH2刺激HepG2细胞后,［Ca2+］c迅速短暂升高（P<0.01）;G0/G1期比例明显降低,S期和G2/M期细胞比例和细胞增殖指数(PI)明显提高（P<0.01）;cyclinD1 mRNA的表达显著增加（P<0.01）。SLIGKV-NH2在1-50 μmol/L时可以促进HepG2细胞增殖,呈剂量依赖性（P<0.01或P<0.05）。而VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著（P>0.05）。结论: PAR-2激动剂在体外能通过激活PAR-2,诱导HepG2细胞内［Ca2+］c升高,上调cyclinD1 mRNA的表达,加速HepG2细胞周期进程,促进DNA合成,促进肝癌细胞增殖。