两种鬼臼毒素脂质体的制备及其比较分析

目的：制备两种含有鬼臼毒素（PPT）的脂质体凝胶剂并比较两者的性能。方法：采用逆向蒸发法制备PPT－二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和PPT－大豆卵磷脂脂质体，光镜和电镜观察2种脂质体的外观形态并测定粒径大小，采用凝胶渗透色层技术测定脂质体的包封率。结果：PPT－DPPC脂质体光镜下为球形，粒径为0．825－2．050um,平均1．450um;PPT－大豆卵磷脂脂质体粒径1．445－7．590um，平均3．780um，电镜下PPT－DPPC脂质体的结构为多室脂质体，包封率为73．8％，PPT－大豆卵磷脂脂质体包封率为79．1％，室温保存1个月后测得PPT－DPPC脂质体的包封率为65．2％，3个月为58．8％，6个月后为56．4％，PPT大豆卵磷脂脂质体的包封率则依次为70．3％，60．4％和51．3。结论：使用逆向蒸发法制备鬼臼毒素的脂质体凝胶剂，方法简便易行，分布较均匀，包封率较高。     

阳离子脂质体包裹bFGF作为免疫佐剂的制备工艺研究

目的 考察阳离子脂质体包裹碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的制备工艺以及在小鼠体内的免疫效应.方法 通过优化如脂质配方、药脂比、挤压次数、冻融次数以及孵化温度等各个工艺参数在保持bFGF高活性的前提下来提高bFGF的包封率.分别用bFGF阳离子脂质体、bFGF弗氏佐剂以及PBS分3组免疫4周龄Balb/c小鼠,连续免疫4次,ELISA测定各组小鼠血清的抗体滴度.结果 优化得到脂质体配方为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)∶1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)=2∶1;药脂比为7.5%;液氮速冻,4 ℃孵化60 min,反复冻融6次;过膜挤压10次.通过工艺的改进,bFGF在脂质体中的包封率得到显著提高,达到50%.免疫实验中通过与弗氏佐剂免疫效果比较,阳离子脂质体作为佐剂产生的bFGF的抗体滴度为1∶3200,免疫效果比较令人满意.结论 免疫实验中发现阳离子脂质体作为免疫佐剂,具有很好的佐剂效应.     

中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方

目的 采用中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的最佳处方。方法 以主动载药-pH梯度法制备亲水基修饰阳离子脂质体,以包封率、Zeta电位为指标,考察长春碱与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）质量比、DPPC与3β-[N-(N′, N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰胺基] 胆固醇（DC-Chol）物质的量之比、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）的质量分数3个因素对考察指标的影响,并对各个因素进行二项式拟合,通过响应面分析选取最佳处方。结果 优化出的长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方为长春碱与DPPC质量比为0.06、DPPC与DC-Chol物质的量之比为1.00、DSPE-PEG 2000的质量分数为7%。结论 中心组合设计-效应面法应用简便、预测性好,制备的长春碱亲水基修饰阳离子脂质体符合设计要求。     

透明质酸修饰的绿原酸脂质体的制备及细胞学研究

目的 制备透明质酸(HA)靶向绿原酸(CA)脂质体,探讨其对HA受体(CD44)高表达A549细胞及低表达HepG2细胞的增殖抑制作用.方法 合成HA-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE);通过薄膜分散法制备HA-CA脂质体并用动态光散射粒径分析仪测定粒径;采用高效液相色谱法(HPLC)建立CA体外水平测定方法并测定HA-CA脂质体的包封率;采用噻唑蓝(MTT)法检测游离CA、CA脂质体及HA-CA脂质体对A549细胞和HepG2细胞的增殖抑制作用;采用荧光细胞摄取实验验证HA脂质体的靶向性.结果 HA-CA的平均粒径为219.20 nm,多分散系数(PDI) =0.16;包封率为(85.36±1.01)％;HA-CA脂质体对A549细胞的增殖抑制作用明显大于CA脂质体,且CA脂质体大于游离CA;CA脂质体和HA-CA脂质体对HepG2细胞的增殖抑制作用则基本相当,均大于游离CA;A549细胞对载6-香豆素HA脂质体(HA-C脂质体)的摄取高于HepG2细胞.结论 HA-CA脂质体能与高表达的HA受体细胞特异性结合,达到肿瘤细胞主动靶向效果.     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

紫杉醇长循环脂质体用于肿瘤小剂量化疗的研究

目的 研制紫杉醇长循环脂质体(paclitaxel stealth liposome，PSL)用于肿瘤小剂量化疗，评价其急性毒性和抗肿瘤作用。方法 制备PSL，其中含有聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和油酸。PEG-DSPE用于延长脂质体的血液循环时间，油酸用于降低脂质体的粒度。利用激光粒度/Zeta电位测定仪和Sephadex G50色谱柱，观察和测定了PSL的粒度分布、Zeta电位和包封率。采用昆明种小鼠，比较了PSL与紫杉醇的急性毒性，并且评价了PSL的长循环效果。采用小剂量给药方案，评价了PSL的抗肿瘤作用。结果 在5%葡萄糖水溶液中，PSL的粒径为(138.6±4.6)nm，Zeta电位为(-31.6±7.9)mV，包封率可达(97.8±2.6)%(n=3)。长循环脂质体显著延长了紫杉醇的血液循环时间，减轻了紫杉醇的急性毒性，同时显著提高了紫杉醇的抗肿瘤作用。采用小剂量给药方案，PSL的抗肿瘤作用显著高于紫杉醇注射液(P<0.01)。结论 PSL包封率高，粒度小，制备工艺简单。与紫杉醇注射液比较，PSL更适用于肿瘤的小剂量化疗。     

山萘酚靶向脂质体的制备与评价

目的 制备山萘酚靶向脂质体(cRGD-LP-KAE)并考察初步稳定性.方法 以L-α-磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(CHO)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环精氨酰甘氨酰天冬氨酸(DSPE-PEG-cRGD)、山萘酚(KAE)为材料,采用薄膜分散法结合微孔滤膜法制备cRGD-LP-KAE;以粒径、包封率等指标筛选胆脂...     

两种方法制备阳离子脂质体包裹蛋白转染法的比较

目的　比较不同方法制备包裹蛋白脂质体的包封率和转染率 ,评价蛋白转染的可行性。方法　采用逆相蒸发法和冻融超声法制备包裹人IgG的阳离子脂质体 ,测定包封率并分别转染小鼠脾细胞 ,用流式细胞术、免疫荧光法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和免疫印迹法检测转染效果。结果　逆相蒸发法制备的脂质体包封率高于冻融超声法 (P <0 .0 1)。两种方法制备的脂质体转染率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　逆相蒸发法制备的阳离子脂质体更适合作为蛋白转染的载体有效地将目的蛋白导入细胞     

足叶乙苷长循环脂质体的制备及血浆中稳定性研究

[目的]研究足叶乙苷长循环脂质体的制备方法并考察其在大鼠血浆中的稳定性.[方法]采用乙醇注入法制备足叶乙苷长循环脂质体,用聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(PEG2000-DSPE)修饰脂质体膜,反相高效液相色谱(HPLC)法测定脂质体浓度,动态透析法考察其在大鼠血浆中的稳定性.[结果]足叶乙苷长循环脂质体的平均粒径为(180±26)nm,含量为(4.78±0.22)mg/mL,药物包封率为(88.71±8.2)%.在大鼠血浆中,普通脂质体和长循环脂质体24 h累积释药率分别为(80.14±1.59)%和(46.72±2.61)%.[结论]乙醇注入法可制得包封率高、粒径小的足叶乙苷脂质体,PEG2000-DSPE修饰脂质体膜可增加脂质体的稳定性.     

两种鬼臼毒素脂质体的制备及其比较分析

目的制备两种含有鬼臼毒素(PPT)的脂质体凝胶剂并比较两者的性能。方法采用逆向蒸发法制备PPT-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和PPT-大豆卵磷脂脂质体,光镜和电镜观察2种脂质体的外观形态并测定粒径大小。采用凝胶渗透色层技术测定脂质体的包封率。结果PPT-DPPC脂质体光镜下为球形, 粒径为0.825~2.050 μm,平均1.450 μm;PPT-大豆卵磷脂脂质体粒径1.445~7.590 μm,平均3.780 μm。电镜下PPT-DPPC脂质体的结构为多室脂质体,包封率为73.8%;PPT-大豆卵磷脂脂质体包封率为79.1%。室温保存1个月后测得PPT-DPPC脂质体的包封率为65.2%、3个月为58.8%,6个月后为56.4%;PPT大豆卵磷脂脂质体的包封率则依次为70.3%、60.4%和51.3%。结论使用逆向蒸发法制备鬼臼毒素的脂质体凝胶剂,方法简便易行,分布较均匀,包封率较高。     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

β1受体基因治疗对肾性高血压大鼠心室重构的影响

目的:观察阳离子脂质体混合物(DOTAP/DOPE)介导的β1受体反义寡核苷酸单次注射对两肾一夹肾性高血压大鼠血压及心肌胶原含量的影响。方法:用雄性SD大鼠制造两肾一夹肾性高血压模型。β1寡核苷酸(β1ODN)末端用FITC标记,阳离子脂质体混合物与β1反义寡核苷酸(β1ASODN)的摩尔比率分别为0,1.5,2.0,2.5,3.0,经鼠尾静脉注射,β1ASODN注射剂量为0.5mg·kg-1。反向寡核苷酸(β1INODN)注射剂量也为0.5mg·kg-1,比率为2.0。共聚焦检测荧光分布。监测血压,8周后测定左、右心室重量和心肌羟脯氨酸含量。结果:FITC标记的β1ASODN主要分布在心肌细胞的细胞浆中,且呈时间依赖性的减弱。当比率为2.0时,可使血压下降维持27d,可以使血压最大下降39mmHg,其降压效果及维持时间最好。β1INODN组左心室重量/体重、左心室肌羟脯氨酸/心肌干重与假手术组相比显著性升高(P<0.01,P<0.01);比率2.0组的左心室重量/体重、左心室肌羟脯氨酸/心肌干重比β1INODN组显著性降低(P<0.05,P<0.01)。结论:单次注射β1受体反义寡核苷酸对2K1C肾性高血压治疗有效,阳离子脂质体混合物与β1ASODN以不同的比率混合后注射,其降压效果及维持时间以及对左室重构的影响有差异,当比率为2.0时最好;且β1ASODN预防与逆转左室肥厚的同时,也降低左室胶原含?     

包裹质粒DNA及线状DNA脂质体的制备

本实验制备组成分别为DOPE/Chol/OA(4:4:3)的酸敏脂质体及DOPC/Chol/OA(4:4:3)脂质体,用于包裹质粒pSV_2-neo、pUC18-ras、pSV-neo-ras及大分子线状DNA,包裹率可达50％.被脂质体包裹的DNA不被DNase降解,提示DNA分子被脂质体包裹在微球体内部.电泳检测表明,被包裹的DNA分子没有断裂.所得到的脂质体较稳定,4℃放置5～6月,脂质体内仍保留部分DNA分子.制备酸敏脂质体时,pH为8.0时脂质体较稳定,pH<6.5～7时则不稳定.     

Inhibition of the activation and collagen production of cultured rat hepatic stellate cells by antisense oligonucleotides against transforming growth factor-beta 1 is enhanced by cationic liposome delivery]

In order to investigate the inhibition of the activation and collagen production of cultured rat hepatic stellate cells (HSC) by antisense oligonucleotides (ASON) against TGF beta 1 after cationic liposome (lipofectin) delivery, the authors synthesized a 20-mer phosphorothioate antisense oligonucleotide of TGF beta 1 mRNA, and its sense of missense oligonucleotides, and then treated the HSC with cationic liposome/oligonucleotide complexes respectively. The cellular uptake of 32P-labelled oligonucleotides was determined by liquid scintillation counting, and HSC activation was assessed by the expression of alpha-smooth muscle actin(alpha-SMA). The cellular uptake of lipofectin/32P-ASON complex was approximately five-fold higher than that of 32P-ASON alone. Cationic liposome (lipofectin) delivery significantly increased the inhibition of HSCs activation by ASON, while compared with the use of naked TGF beta 1 ASON at the same concentration (at a final concentration of 1 mumol/L, P < 0.05). However, these effects were not observed in lipofectin alone, liposome/sense or missense oligos complexes at the same concentration. The oligonucleotide or lipofectin/oligos complexes had no cytotoxicity to rat HSCs in culture. These findings suggest that cationic liposome is an effective vehicle to improve the delivery of ASON to rat HSCs in culture, and the cationic liposome/TGF beta 1 ASON complex may be useful for the treatment of hepatic fibrosis.     

聚乙二醇修饰的阳离子脂质体作为siRNA传递系统的处方优化

研究摩尔分数为0%~5%的聚乙二醇（PEG）修饰的阳离子脂质体作为siRNA传递系统的优劣。制备了两组高低电荷的空白阳离子脂质体,分别含有摩尔分数为40%和20%的1,2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷（DOTAP）,以人胰腺癌细胞株Hs-766T作为细胞模型,比较了细胞膜表面结合量及内吞量分别随时间和细胞外给药浓度变化的动力学曲线;结果显示4 h时细胞表面结合达到稳态,高电荷脂质体组与细胞的结合量明显高于低电荷脂质体组,PEG的加入使脂质体与细胞表面的不饱和型结合转变为可饱和型。采用共聚焦显微镜定性观察载siRNA的阳离子脂质体在6 h的细胞内分布情况,结果表明摩尔分数为40%DOTAP与0%~2%PEG组合有效地将siRNA转运至细胞质,而40%DATAP与5% PEG组合对转运无效。     

载Ca2+温度敏感性脂质体的合成

目的合成包裹Ca2+的温度敏感性脂质体,仿生生物矿化过程中的基质小泡分泌钙磷离子,为仿生矿化的研究提供一种矿化离子供给的研究手段。方法采用相交融合(IF)法,以相变温度较低(24℃)的二肉豆蔻卵磷脂(DMPC)和相变温度较高的(41℃)二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)为原料,调节两者的质量比为9∶1,使合成的脂质体膜在37℃左右发生相变,致通透性增加,包裹物释放。通过与CaCl2溶液的水合,合成包裹Ca2+的温度敏感性脂质体,并对脂质体的特性进行表征。结果所获脂质体的平均粒径为161.3 nm,Ca2+的包裹率为60%～85%。室温条件下脂质体稳定,在37℃条件下,Ca2+可以持续释放。结论以DPPC和DMPC为原料,合成的包裹Ca2+温度敏感性脂质体,在生理条件下可以实现Ca2+释放,为仿生矿化的研究模型提供了一种仿生基质小泡分泌钙磷离子的研究工具。     

甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体的抗肿瘤作用实验研究

目的研究甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体的抗肿瘤作用。方法用胆固醇氯甲酸醋和N,N-二甲基乙二胺反应生成313[N-（N’,N’-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰]胆固醇（DC—chol）,以DC—chol、二棕榈磷脂酰基乙醇胺（DoPE）和N-[2-（胆固醇氧羰基氨基）乙基]用氨酰甲基化革露聚糖（chol—AECM—mannan）为原料合成甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体,检测脂质体粒径大小。应用C57小鼠制备移植性肺癌模型,静脉给予各种纳米脂质体（实验纳米脂质体,无革露聚糖修饰的包裹有EGFR的纳米脂质体、空纳米脂质体）及对照EGFR,观察小鼠的一般情况及肿瘤生长情况;行ELISA和Western Blotting检测小鼠血清中抗体漓度差别。结果脂质体粒径大小为132．6nm。ELISA和Western Blotting检测均显示实验组小鼠血清有抗体产生而且抗体漓度远大于其他对照组。实验组肿瘤体积明显小于对照组（EGFR及空白脂质体组,P〈0．05）。结论研究结果表明实验组小鼠肿瘤生长受到抑制,甘露聚糖修饰的靶向纳米脂质体对小鼠肺癌有一定疗效。