Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病肾组织中的表达

目的:探讨Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病模型肾组织中的表达及可能作用。 方法:采用单侧输尿管结扎（UUO）模型，分别于造模后1、3、7、14、21和28 d取肾组织，用免疫组化法检测TGFβ₁、磷酸化Smad2/3和α-SMA在梗阻肾肾组织中的表达；用原位杂交方法检测梗阻肾组织TGFβ₁ mRNA的表达。结果:正常大鼠肾组织具有基础的TGFβ₁(4.32%±1.72%)和磷酸化Smad2/3［(19.31±5.37）个/mm2］的表达，α-SMA只表达于血管平滑肌，肾小管-间质无表达。UUO术后1 d，TGFβ1的表达无明显增加(5.15%±2.08% vs对照组，P>0.05)，第3 d明显增加(13.55%±6.33% vs 对照组，P<0.01)，第7 d达高峰(26.78%±8.77% vs 对照组，P<0.01)，此后表达减少；磷酸化Smad2/3的表达在UUO术后3 d明显增加［(67.95±13.87）个/mm2 vs 对照组，P<0.01］，并持续增加到第7 d［（150.61±27.34）个/mm² vs 对照组，P<0.01］，此后表达减少；而UUO术后3 d肾组织α-SMA表达亦明显升高（5.58％±1.23％ vs 对照组，P<0.01），7 d达到高峰（13.43％±3.32％ vs 对照组，P<0.01），14 d表达开始下调；UUO术后肾间质细胞外基质的沉积随着疾病的进展而进行性增加，第28 d达到最高峰。梗阻肾肾组织中TGFβ₁、磷酸化Smad2/3以及α-SMA的表达时相一致并呈明显正相关（r₁=0.932, P<0.01；r₂=0.946, P<0.01），并与肾间质区域细胞外基质的积聚密切相关。 结论:磷酸化Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病肾组织中的表达明显增高，可能在肾间质纤维化的过程中起重要作用。     

糖尿病大鼠肺组织p38 MAPK活性变化的研究

目的:观测糖尿病大鼠肺组织的病理改变及p38MAPK活性的变化。方法:复制糖尿病(DM)大鼠模型,4周后观察其肺部组织病理改变;采用改良的Takay法测定蛋白激酶C(PKC)活性,蛋白质免疫印迹分析(Westernblot)及免疫组化方法检测转化生长因子β₁在DM大鼠肺组织表达变化并以原位杂交方法检测丝裂原激活的蛋白激酶p38(p38MAPK)活性。结果:DM大鼠4周后毛细血管壁及肺泡间隔增厚,肺间质胶原成份增多,TGF-β₁在肺组织表达增多,肺组织PKC、p38MAPK活性增强。结论:链脲菌素糖尿病大鼠肺组织高糖环境下细胞内外信号传导系统PKC-p38MAPK被激活,可能参与糖尿病肺部并发症的发生和发展。     

三七皂苷单体R1 抑制低氧高二氧化碳诱导的肺动脉平滑肌细胞p38 MAPK信号通路的活化

目的: 探讨三七皂苷单体R₁(R₁)减轻低氧高二氧化碳(CO₂)性肺动脉收缩的作用及其与p38 MAPK信号通路的关系。方法: 原代培养雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),取第2至5代对数生长期细胞至低氧高CO₂(1% O₂, 6% CO₂)条件下继续培养,并分别用8、40、100 mg/L R₁ 孵育24 h后收集细胞,采用免疫印迹法测定p38 MAPK磷酸化蛋白表达,半定量RT-PCR检测p38 MAPK mRNA的表达。结果: Western blotting和RT-PCR结果显示,低氧高CO₂组p-p38 MAPK蛋白和p38 MAPK mRNA表达明显高于对照组(N)组(P<0.01)。与低氧高CO₂组相比,R₁(8、40、100 mg/L)不同程度抑制了p-p38 MAPK蛋白和p38 MAPK mRNA的表达(P<0.01),并呈剂量依赖关系。结论: 低氧高CO₂诱导PASMCs p38 MAPK活化,三七皂苷单体R₁可能通过抑制p38 MAPK通路减轻低氧高CO₂性肺动脉收缩。     

单侧输尿管梗阻大鼠模型中p38MAPK表达与细胞凋亡

目的： 探讨p38MAPK在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型肾组织中的表达及其在肾小管间质细胞凋亡和纤维化过程中可能发挥的作用。方法: 将25只Wistar大鼠中的18只行左侧输尿管结扎术，另外7只行假手术。分别于术后第3、7和14 d处死各组大鼠，行HE和Masson染色，观察肾脏病理变化；免疫组织化学方法测定增殖细胞核抗原（PCNA）表达；原位末端标记法（TUNEL）与DNA电泳观察肾小管间质细胞凋亡情况；Western blotting检测肾组织半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和p38丝裂素激活蛋白激酶（p38MAPK）及其磷酸化产物（p-p38MAPK）的表达。结果: 与假手术组比较，UUO模型组肾脏病理改变加重，TUNEL染色及DNA琼脂糖凝胶电泳可见大量的肾小管间质细胞凋亡，肾间质细胞PCNA表达明显增加，肾组织caspase-3的表达也显著增加（P<0.05）。p38MAPK蛋白水平在各组之间比较没有明显差别（P>0.05）。p-p38MAPK蛋白在正常肾脏有低水平表达，UUO模型组随着梗阻时间延长表达逐渐增多；第7 d达高峰，第14 d开始下降（P<0.05）。结论: p38MAPK信号通路可能参与了UUO致肾小管间质细胞凋亡和肾间质纤维化过程。     

TGF-β2,p38MAPK在哮喘气道重塑模型中的表达

目的:建立哮喘气道重塑模型并检测IL-13、TGF-β₂在气道重塑中的表达。方法: 建立气道重塑模型,光镜、电镜下观察形态学改变;应用原位杂交技术检测IL-13、TGF-β₂ mRNA表达,Western blot 检测p38MAPK蛋白表达。结果: 气道重塑模型表现为明显的上皮增生,粘液产生增加,平滑肌细胞增生、上皮下大量胶原沉积,同时伴显著的炎症细胞浸润,显著表达IL-13,TGF-β₂ mRNA及p38MAPK蛋白。结论: 气道重塑肺组织显著表达IL-13、TGF-β₂ mRNA、p38MAPK,表明Th2细胞因子、TGF-β在气道重塑中可能起一定作用,提示p38MAPK可能与哮喘的发病过程并与气道重塑相关。     

长期容量超负荷心力衰竭大鼠心脏交感神经去甲肾上腺素转运蛋白表达的变化

目的：检测长期容量超负荷（VOL）条件下大鼠心肌β₁-肾上腺素能受体（β₁-AR）及其上游调控因素心脏交感神经去甲肾上腺素转运蛋白（NET）mRNA表达的变化。方法：用RT-PCR及Northern杂交检测心脏交感神经NET表达组织特异性、VOL后不同时间大鼠心脏交感神经NET及β₁-AR mRNA表达水平变化。结果：①心脏交感神经节专一性表达心脏交感神经NET基因。②VOL后3 d大鼠左心室收缩压（LVSP）下降最显著（24%）（P<0.05）此后逐渐增高,至手术后60 d高于对照组32.8%（P<0.05）;3-30 d舒张末压（LVEDP）显著增177.96%-234.75%（P<0.05）,术后60 d恢复至对照组水平（P>0.05）。③与对照组比较VOL大鼠术后3-30 d NET、β₁-AR mRNA表达无下降（P>0.05）,60 d NET RT-PCR及Northern杂交检测分别显示下降43.3%（P<0.05）和 63.5%（P<0.05）,Northern杂交显示β₁-AR下降50%（P<0.05）。结论：长期心脏VOL大鼠左心室β₁-AR mRNA可维持较长时间稳定与心脏交感神经NET mRNA表达相对稳定有关。NET表达正常对维持β₁-AR对肾上腺素能刺激的敏感性,维持心脏收缩功能正常可能有重要意义。     

肾上腺髓质素拮抗转化生长因子β1的促纤维化作用及其机制

目的:探讨肾上腺髓质素(AM)在人肾小管上皮细胞系(HK-2)对转化生长因子β₁(TGFβ₁)促纤维化作用的影响及机制。方法:细胞总胶原的合成和分泌以[³H]-脯氨酸掺入量及培养液内[³H]-羟脯氨酸放射活性来判断;ELISA法检测培养液中纤维连接蛋白(FN)含量;FN、IV型胶原和组织型金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)mRNA的表达采用RT-PCR法;信号蛋白Smad2及Smad6蛋白表达采用Westernblot法。结果:(1)AM在蛋白和mRNA水平均明显抑制TGFβ₁刺激的胶原和纤维连结蛋白的表达;(2)AM抑制TGFβ₁刺激的TIMP-1mRNA的上调;(3)AM(10^-8mol/L)本身对Smad2和Smad6的表达无明显影响,且对TGFβ₁刺激的Smad2的表达也无明显影响;但是可以明显上调被TGFβ₁抑制的Smad6的表达。结论:在HK-2细胞,AM通过上调抑制性Smad6的表达拮抗TGFβ₁的促纤维化作用。     

p38MAPK信号通路在雨蛙素诱导的胰腺AR42J细胞炎症反应中的作用

目的: 探讨p38 MAPK信号通路在急性胰腺炎体外模型中的作用。方法: AR42J细胞随机分为3组:正常对照组、雨蛙素组(10^-8mol/L雨蛙素)和SB203580组(10 μmol/L SB203580+10^-8mol/L雨蛙素)。于3 h收集细胞,检测淀粉酶分泌率;免疫荧光染色观察p-p38 MAPK核移位;Western blotting印迹检测p-p38 MAPK和TNF-α蛋白表达;EMSA检测NF-κB活性。结果: 与正常对照组比较,雨蛙素组淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白水平增高(P<0.01),p-p38 MAPK表达及NF-κB活性表达增加(P<0.01);免疫荧光示雨蛙素组p-p38 MAPK发生了核移位。而与雨蛙素组相比,SB203580组明显降低淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白表达(P<0.01),p-p38 MAPK和NF-κB的活性表达也下降(P<0.05);SB203580还抑制了p-p38 MAPK核移位。结论: p38 MAPK通路参与了胰腺细胞内的炎症反应,其机制可能涉及NF-κB通路的活化。     

糖尿病大鼠肾小管骨调素和p38MAPK表达的动态研究

目的:动态观察骨调素（OPN）在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾小管的表达，探讨它与p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、核转录因子-κB（NF-κB）及肾损害之间的关系。方法：雄性SD大鼠，注射STZ诱导糖尿病（DM），随机分成5组，每组分别设鼠龄匹配的正常对照组。免疫组化方法检测肾小管OPN、p38MAPK、NF-κB及纤连蛋白（FN）的表达；Western印迹法检测肾皮质OPN和p38MAPK蛋白质水平；生化方法测定血糖、血肌酐及24 h尿蛋白量；光镜检查肾组织的形态改变。结果： Western印迹和免疫组化检测发现糖尿病3 d大鼠肾组织p38MAPK和DM 7 d OPN的表达增多，并随病程发展而增加，与正常对照组比较有显著差异（P<0.01）。DM 4周，肾小管OPN的表达与p38MAPK、NF-κB、FN表达及蛋白尿呈显著正相关。结论： 糖尿病大鼠肾小管OPN表达增加参与了糖尿病肾小管间质损害的发病机制；肾小管p38MAPK可能介导了DM状态时NF-κB的表达，进而调节OPN的表达增多。     

Manumycin诱导细胞凋亡抑制乳腺癌细胞SK-BR-3活性

目的:研究manumycin对乳腺癌腹腔转移癌细胞株SK-BR-3的抑癌效应及其诱导凋亡。方法:用MTT法检测manumycin对SK-BR-3细胞的抑癌作用。免疫印迹方法检测p38 MAPK蛋白表达。用caspase-3活性检测试剂盒定量检测manumycin诱导细胞凋亡的水平及评估特异性的p38 MAPK抑制剂SB203580对凋亡的影响。结果:经6 μmol/L、18 μmol/L、54 μmol/L manumycin处理SK-BR-3细胞24 h时,其抑制率分别为(7.4±3.9)%、(21.0±4.4)%和(64.7±4.1)%,呈量效关系。其中后2者的细胞活性与对照组比有显著差异(P<0.01)。用药24 h的IC₅₀为42.5 μmol/L。同时此药物可明显增加caspase-3的活性,且这一效应可部分地被p38抑制剂SB203580阻断。免疫印迹结果显示manumycin促进p38的磷酸化。结论:manumycin可通过诱导SK-BR-3细胞凋亡而产生抑癌作用,p38 MAPK是manumycin诱导细胞凋亡的通路之一。     

盐酸吡格列酮对糖尿病大鼠肾组织TOLL 受体4 / MAPKs 信号通路的影响

目的:探讨吡格列酮对糖尿病肾病大鼠肾组织中TOLL 受体4/ MAPKs 信号通路的影响。方法:将雄性SD 随机分为对照组(n =8)和试验组(n =32)。试验组SD 鼠造模成功后随机分为3 组进行干预,应用Western blot 检测对照组和干预组大鼠肾组织中丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2 及p38MAPK 磷酸化水平。结果:与对照组比较,各组大鼠肾组织中TOLL 受体4 表达增强,其中ERK1/2 与JNK 磷酸化水平明显升高(P<0郾05),但p38MAPK 水平变化不明显(P>0郾05);与模型组比较,吡咯列酮干预组大鼠肾组织中ERK1/2 与p38MAPK 磷酸化水平降低(P<0郾05)。结论:吡格列酮通过TOLL 受体4/ MAPKs/ERK1/2 与TOLL 受体4/ MAPKs/ JNK 信号通路来完成,延缓糖尿病肾病的发生与发展。     

Increased Heat Shock Protein-70 in Unilateral Ureteral Obstruction in Rats

Our previous studies noted the oxidative stress of unilateral ureteral obstruction (UUO). Now, we seek to explore whether UUO affects the intrinsic cellular antioxidants and triggers heat shock protein (HSP-70) and whether these are still highly expressed after reversal of the UUO (R-UUO). In addition, we designed the experiment to determine whether this expression of HSP-70 is a localized or a generalized response. Male Sprague–Dawley rats (125–150 g) were randomly assigned to sham operation, left UUO, or R-UUO procedures at six rats per group. The sham, UUO, and R-UUO animals were studied 10 days after UUO or 7 days after R-UUO. A clear increase in the left (obstructed) kidney's malondialdehyde (MDA), a marker of lipid peroxidation, was observed: a significant 2.6-fold of sham during UUO and a 1.7-fold of sham in R-UUO. The contralateral (unobstructed) right kidney showed a significant rise in MDA during UUO, but during R-UUO the MDA had fallen back to sham values. It is possibly the result of a systemic effect from the free radicals produced by the oxidative stress of the UUO. The antioxidant enzyme, manganese superoxide dismutase (MnSOD) of the left, obstructed kidney showed a significant reduction in UUO compared to that of the sham. Upon reversal of UUO (R-UUO), MnSOD was lower than that of the sham. The left kidney's HSP-70 increased during UUO and was 3.7-fold that of sham (P< 0.05) but, during R-UUO, was not different from sham (P,ns). The contralateral (intact) right kidneys' HSP-70 showed no change between sham, UUO, and R-UUO states. We conclude that UUO gives rise to oxidative stress which is generalized in both the obstructed and the contralateral unobstructed kidney, as indicated by the elevation in kidney MDA content in both kidneys. The intrinsic cellular antioxidant enzyme, manganese superoxide dismutase, showed a significant and generalized reduction in both UUO and R-UUO. In contrast, the HSP-70 was markedly elevated only in the obstructed kidney and not in the R-UUO or in the contralateral kidney, suggesting that the elevation of HSP-70 is a specific and localized response to oxidative injury of UUO.     

Attenuation of renal fibrosis by proteasome inhibition in rat obstructive nephropathy: possible role of nuclear factor kappaB

We previously reported that pyrrolidine dithiocarbamate blocked nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) activation and attenuated interstitial inflammation and tubulointerstitial fibrosis in the rat obstructive nephropathy. Since pyrrolidine dithiocarbamate is an anti-oxidant and possesses additional biological properties, present experiment was conducted to clarify further the role of NF-kappaB in the development of tubulointerstitial fibrosis in obstructed kidney using a proteasome inhibitor that blocks NF-kappaB through stabilizing IkappaB, an endogenous inhibitor of NF-kappaB. At 5 days following unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats, obstructed kidney exhibited tubulointerstitial fibrosis that was associated with macrophage infiltration. UUO decreased renal cortical IkappaB protein contents with concomitant increases in NF-kappaB DNA-binding activity and gene expression of monocyte chemoattractant protein-1. Administration of PSI, N-benzyloxy-carbonyl-Ile-Glu (O-t-Bu)-Ala-leucinal, a proteasome inhibitor, (3 mg/kg/day, s.c., b.i.d) to UUO rats inhibited proteasome activity and attenuated the changes in IkappaB content, NF-kappaB activity and MCP-1 mRNA expression observed in UUO rats. PSI also decreased macrophage influx and attenuated the development of fibrosis. Furthermore, up-regulated gene expression of pro-fibrogenic molecules observed in the obstructed kidney was attenuated by PSI. These results further support the notion that NF-kappaB plays an important role in the development of renal fibrosis in the obstructive nephropathy.     

酸性成纤维细胞生长因子对大鼠急性肺损伤的影响

目的探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的作用及其影响机制。 方法将60只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为3组：阴性对照组、脂多糖损伤组、aFGF干预组,每组20只。采用经气管插管给予脂多糖5 mg·kg^－1制备大鼠ALI模型,aFGF干预组则于给予脂多糖24 h后,经气道给予aFGF 1 000 μ·g^－1。3组均于48 h后苏木精-伊红染色观察肺组织病理学改变,计算肺损伤评分,测定肺水清除率,称量肺湿/干重比,免疫组织化学染色法观察肺泡表面活性蛋白C(SP-C)的表达,酶联免疫吸附试验法测定肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。蛋白质印迹法检测肺组织磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)蛋白表达水平。数据采用单因素方差分析(进一步两两比较采用LSD法)或非参数检验。 结果(1)aFGF干预组肺损伤评分[(6.33±0.42)分]与脂多糖损伤组肺损伤评分[(11.00±0.37)分]较阴性对照组[(1.01±0.26)分]均升高,但aFGF干预组肺损伤评分明显低于脂多糖损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)aFGF干预组肺水清除率[(27.41±1.05)%]与脂多糖损伤组肺水清除率[(15.59±0.64)%]较阴性对照组[(30.63±0.91)%]均有所下降,但aFGF干预组明显高于脂多糖损伤组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)脂多糖损伤组肺水聚集(肺湿/干重比为6.32±0.32)较阴性对照组(4.17±0.05)明显升高,aFGF干预组(5.18±0.10)也高于阴性对照组,但与脂多糖损伤组相比,肺湿/干重比有所改善且差异有统计学意义(P<0.05)。(4)aFGF干预组TNF-α水平[(762.50±23.93) pg/mL]与脂多糖损伤组TNF-α水平[(1460.01±17.96) pg/mL]较阴性对照组[(49.51±10.75) pg/mL]均明显升高,但aFGF干预组较脂多糖损伤组有明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)aFGF干预组p-p38 MAPK/β-actin比值(0.38±0.01)明显高于阴性对照组(0.18±0.01),差异有统计学意义(P<0.05),且明显高于脂多糖损伤组(0.12±0.01),差异有统计学意义(P<0.01)。 结论aFGF对脂多糖诱导的ALI大鼠具有肺保护作用,其机制可能为aFGF通过激活p38 MAPK通路,减少细胞凋亡,促进肺泡上皮细胞再生所致。     

周期性张应力对骨性关节炎软骨细胞p38 MAPK表达及其磷酸化的影响

目的: 观察周期性张应力(cyclic tensile strain,CTS)对兔骨性关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达及其磷酸化的影响,探讨力学载荷在骨性关节炎的病理过程中的作用。方法: 实验动物行一侧前交叉韧带切断术(ACLT)制作OA动物模型,术后10周消化分离兔膝软骨细胞体外培养,非手术侧软骨细胞为正常组, OA细胞随机分为低应力组、高应力组以及对照组,分别加载0.1 Hz、1.0 Hz、0 Hz的周期性张应力。加载应力24 h、1周和2周后RT-PCR和Western blotting测定各组p38 MAPK及其磷酸化产物表达水平。结果: 在各时点各组p38 MAPK均有不同程度的表达,其中加载CTS前,正常组与OA对照组相比差异非常显著(P<0.01);加载CTS 1周后,高应力组与低应力组差异有统计学意义(P<0.05);加载CTS 2周后,低应力组与对照组差异非常显著(P<0.01)。Western blotting显示p38 MAPK磷酸化产物在对照组和OA+高应力组持续表达,而OA+低应力组在24 h、1周、2周3个时点的表达逐渐下降。结论: 力学载荷可影响p38 MAPK的表达及磷酸化程度,骨性关节炎的发展发生与应力在细胞分子水平上相互影响。     

结缔组织生长因子在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达及其意义

目的： 观察结缔组织生长因子（CTGF）在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中的动态表达，探讨CTGF在肾小管间质纤维化中的作用机制。方法： 将48 只Wistar大鼠随机分为UUO组和假手术（SO）组，采用左输尿管结扎术复制UUO模型，于术后1、3、7、14 d分别处死2组大鼠取左肾。采用Masson染色评定肾小管间质损伤程度；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 方法检测肾组织转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、CTGF、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）mRNA表达；免疫组织化学方法测定TGF-β₁、CTGF、ColⅠ、PAI-1表达；Western blotting方法检测CTGF蛋白表达量的变化。结果: UUO术后1d，梗阻肾TGF-β₁ mRNA表达开始升高，第3-14d时升高更显著（P<0.01），CTGF、ColⅠ、PAI-1 mRNA水平随之逐渐升高。免疫组织化学染色发现，UUO大鼠肾小管和间质区域CTGF表达随病程进展逐渐增强；相关分析显示，UUO术后第7d，CTGF表达量与肾小管间质损伤指数、肾小管间质TGF-β₁、ColⅠ、PAI-1表达强度均呈正相关，相关系数（r）分别为0.62、0.85、0.78和0.76（均P<0.01）。Western blotting结果显示，CTGF蛋白水平在术后第3d开始上升，随病程进展更显著。结论: CTGF可通过促进细胞外基质产生和抑制细胞外基质降解双重途径诱导肾小管间质纤维化的发生和进展。