肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3~+CD56~+细胞的体外扩增能力

目的探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)输注治疗对再次制备CIK细胞亚群的构成和活性的影响。方法选取经2个疗程CIK细胞治疗的患者201例,分为CIK治疗后90 d内(含90 d)制备检测组和大于90 d制备检测组。台盼蓝拒染法检测细胞增殖;流式细胞术分析CD3、CD4、CD8,CD56和NKG2D受体表达情况的变化;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果 CIK细胞输注治疗后90 d内再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞百分率(16.7±9.1)%,与CIK细胞输注治疗前相比(13.5±8.6)%,显著增加(P0.01),而且,表面受体NKG2D表达水平((84.1±10.8)%,也比CIK细胞输注治疗前明显增高((81.1±14.8)%)(P0.05)。与此相反,CIK细胞输注治疗后导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(15.2±9.7)%,与CIK输注治疗前(17.6±12.5)%相比,显著下降(P0.01)。值得注意的是,CIK细胞输注治疗后超过90 d再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞分布和NKG2D受体表达,与CIK细胞输注治疗前相比均无明显变化,但CIK细胞输注治疗后仍可导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(14.5±9.4)%,与CIK细胞输注治疗前相比(18.2±12.9)%,明显下降(P0.01)。另外,2组再次制备CIK细胞的总数和体外细胞杀伤活性无明显差异。结论 CIK细胞输注治疗有助于提高肿瘤患者CD3+CD56+细胞前体细胞,在相同CIK细胞培养制备体系中增殖、定向分化和活化的能力,该作用持续时间不超过90 d,因此,CIK细胞治疗疗程间隔时间不应超过90 d。     

不同输注途径对CIK细胞体内分布和抑瘤作用的影响

目的 研究不同输注途径(皮下、腹腔、瘤周注射)对CIK细胞在活体内的分布规律和抑瘤活性的影响.方法 以同位素32P-adATP标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布.裸鼠皮下注射结肠癌细胞建立肿瘤活体模型,分别按瘤周、腹腔和尾静脉注射途径接受CIK细胞治疗,观察肿瘤的体积和重量变化.结果 CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高,CIK细胞在各脏器的分布规律与不同的输注途径存在一定的联系.裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后,瘤周和尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射CIK细胞对于皮下肿瘤的抑制没有统计学意义.结论 CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效.     

单次大剂量与多次小剂量输注CIK治疗鼠肠癌效应的实验研究

探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)单次大剂量与分次小剂量输注两种治疗模式的抗肿瘤的作用。建立BALB/c小鼠结肠癌模型;体外诱导培养小鼠CIK细胞,7天后CIK单次大剂量组荷瘤鼠接受总剂量为1×107的CIK细胞一次性输注;CIK分次小剂量组荷瘤鼠分5次(隔天1次)接受总剂量与单次组相同的CIK细胞输注,绘制肿瘤生长曲线;治疗后第14天,采用流式细胞术检测各治疗组小鼠脾细胞CD3+、CD4+、CD8+、NK1.1+、DX5+等细胞表型;建立CIK治疗后小鼠脾细胞对C26皮下移植瘤的预防和治疗模型,预防模型统计一周出瘤率,治疗模型生存资料分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验;ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞经C26抗原刺激后分泌IFN-γ的能力。结果CIK单次治疗组小鼠肿瘤生长平均体积(253.30±43.59)mm3明显小于CIK分次治疗组(384.36±43.59)mm3,差异有统计学意义(P=0.042);CIK单次治疗组小鼠脾细胞相对于CIK分次治疗组、PBS对照组对C26结肠癌移植瘤表现出更好的预防和治疗效应(P0.05);CIK单次治疗组小鼠脾细胞较其余各组CD4+T细胞比例下调,而CD8+T细胞比例上调,差异有统计学意义(P0.05),而CD3+、NK1.1+、DX5+等细胞表型各组之间差异无统计学意义(P0.05);CIK单次治疗组小鼠脾细胞在经C26抗原刺激后分泌IFN-γ的能力最强,差异较其余各组有统计学意义(P0.05)。提示CIK单次大剂量输注较分次小剂量输注对BALB/c皮下结肠癌(C26)荷瘤小鼠具有更好的激发机体免疫应答效应以及肿瘤预防和治疗作用。     

体外扩增的Treg细胞抑制NK细胞介导的抗肿瘤免疫

目的研究CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)对NK细胞肿瘤杀伤力的影响及Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制的机制;初步探讨过继输注NK细胞逆转Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制的作用。方法免疫磁珠分离法(MACS)分离得小鼠脾脏Treg细胞及NK细胞,用流式细胞术检测其纯度。以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和重组小鼠白介素2(rm IL-2)联合刺激体外扩增Treg细胞,重组小鼠白介素15(rm IL-15)、rm IL-2以及氢化可的松联合刺激体外扩增NK细胞。将扩增后Treg细胞及NK细胞按不同比例混合淋巴细胞培养,MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性。将B16-F10小鼠黑色瘤细胞输注至Balb/c小鼠体内建立肺移植瘤模型[1],将荷瘤小鼠分为4组:A组单独接种B16-F10小鼠黑色瘤细胞;B组接种Treg细胞+B16-F10黑色素瘤细胞;C组接种B16-F10黑色素瘤细胞+NK细胞;D组接种Treg细胞+B16-F10黑色素瘤细胞+NK细胞。MTT比色法测定各实验组小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性,并比较不同处理组小鼠肺部肿瘤结节数目。结果体外扩增后的Treg细胞对新鲜分选及扩增后的NK细胞活性均具有明显抑制作用(P0.05),且抑制作用呈剂量依赖关系;A组荷瘤小鼠NK细胞活性低于正常小鼠,且B组荷瘤小鼠NK细胞活性较A组进一步降低(P0.05);D组荷瘤小鼠NK细胞活性高于A组和B组荷瘤小鼠,但仍低于正常小鼠组(P0.05)。B组荷瘤小鼠肺部移植瘤数目(105.33±10.97)较A组明显增多(17±4.58)(P0.01);C组荷瘤小鼠肺部移植瘤数目(2.00±1.00)较A组(17±4.58)明显减少(P=0.037);D组荷瘤小鼠肺移植瘤数目(79.00±8.54)较B组明显降低(105.33±10.97)(P=0.030),但仍高于A组荷瘤小鼠(17±4.58)(P0.001)。结论体内种植肿瘤会抑制机体NK细胞活性;输注体外扩增Treg细胞能够通过抑制NK细胞发挥抗肿瘤免疫抑制;过继输注体外扩增NK细胞能够部分逆转Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制。     

125I标记抗人CD40 mAb 5H6在荷人卵巢癌(HO8910)BALB/c裸鼠体内分布及放射免疫显像

目的研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像.方法氯胺-T法进行mAb 5H6125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进行Scatchard分析计算解离常数Kd及最大结合位点数Bmax;建立荷人卵巢癌(HO8910)裸鼠模型,分析125I-5H6在体内的分布,并用SPECT进行放射免疫显像.结果mAb 5H6标记率为(85.4±5.2)%,放射化学纯度为(99.2±0.5)%,125I-5H6免疫活性分数为(38.6±5.4)%,与HO8910细胞的亲和力Kd=(0.711±0.06)nmol/L.在荷瘤鼠体内特异性结合HO8910肿瘤,48小时达到高峰,放射免疫显像肿瘤清晰可见.结论125I-5H6同卵巢癌HO8910细胞在体外结合具有很高亲和力,在体内能特异性结合HO8910肿瘤,能获得优质的放射免疫图像.     

应用rmIL-18 诱导肿瘤特异性CTL 治疗肝癌的实验研究

目的:研究rmIL-18 在体外培养系统(Coculture system in vitro,CCs)诱导肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)及在小鼠体内发挥的抗肝癌效果。方法:采用Stem SepTM 免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK 细胞、T 细胞及DCs,建立体外培养系统;采用不同途径,不同剂量CTL 免疫肝细胞癌荷瘤小鼠,研究CTL 对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响。结果:rmIL-18 能够在体外培养系统中诱导并促进CTL 介导的肿瘤特异性杀伤效应;CTL能够明显抑制荷肝癌小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)及明显延长荷瘤小鼠生存时间(P<0.01),并且这种作用随rmIL-18 浓度的增加而增强(P<0.01),且肿瘤内注射均优于腹腔内注射(P<0.01)。结论:rmIL-18 可以在体外诱导肿瘤特异性CTL 并在小鼠体内发挥抗肝癌作用。     

不同输注途径对CIK细胞治疗后的体内分布的影响

目的：探讨经不同途径输注后CIK细胞的体内分布和代谢情况.方法：分别以同位素^32P-α dATP和荧光染料CM-DiI标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法和荧光显微镜检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布.结果：CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高;CIK细胞输入体内的早期,尾静脉注射途径中肺最先达到分布高峰,而腹腔注射途径中腹腔内器官率先达到分布高峰;CIK细胞在肝、脾的存活可达2周以上.结论：CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;血管输入途径可能更适于血供丰富器官肿瘤的治疗,而体腔输入途径也许更适合于体腔内恶性渗液或局限病灶的治疗.     

输注体外扩增的同源CD4~+CD25~+调节性T细胞增进小鼠肿瘤易感性

目的研究过继输注体外扩增同源调节性T细胞(Treg)对小鼠抗肿瘤免疫的影响,探索过继输注Treg治疗方法可能存在的风险。方法免疫磁珠分离法分离小鼠脾脏内CD4+CD25+Treg,流式细胞术测定其纯度后予以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和大剂量IL-2(1 000 U/mL)刺激,进行2周2轮次扩增后收集Treg,混合淋巴细胞培养测定其体外抑制功能;后将1×107Treg静脉注射BALB/c小鼠,24 h后再注射B16F10肿瘤细胞,同时设置单独接种肿瘤细胞组,14 d后计数肺部移植瘤数目,测定外周血Treg比例。结果新鲜CD4+CD25+Treg纯度大于95%,平均96.3%±2.88%,体外扩增后纯度大于85%,平均87.73%±2.35%;与新鲜Treg相比,扩增后抑制功能未受损(P0.05);给BALB/c小鼠注射1×106B16F10细胞后14 d肺部肿瘤结节数为(14±5)个,先注射1×107体外扩增Treg后再注射1×106B16F10细胞,肿瘤结节数增多为(73±9)个(P=0.007),与单独注射2×106B16F10细胞相当(86±8)个(P=0.230);给C57BL/6小鼠输注5×105B16F10细胞后结节数为(70±15)个,预先输入8×106体外扩增Treg后再注射5×105B16F10细胞,肺部肿瘤结节数明显增多,大于300个,与前者相比,差异有统计学意义(P0.01),同时荷瘤小鼠外周血Foxp3+Treg比例上升更为显著(P0.05)。结论过继输注体外扩增Treg诱导移植物免疫耐受的同时,可能抑制机体的抗肿瘤免疫,因此存在一定风险。     

输注体外扩增的同源CD4^+CD25^+调节性T细胞增进小鼠肿瘤易感性北大核心CSCD

目的研究过继输注体外扩增同源调节性T细胞(Treg)对小鼠抗肿瘤免疫的影响,探索过继输注Treg治疗方法可能存在的风险。方法免疫磁珠分离法分离小鼠脾脏内CD4+CD25+Treg,流式细胞术测定其纯度后予以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和大剂量IL-2(1 000 U/mL)刺激,进行2周2轮次扩增后收集Treg,混合淋巴细胞培养测定其体外抑制功能;后将1×107Treg静脉注射BALB/c小鼠,24 h后再注射B16F10肿瘤细胞,同时设置单独接种肿瘤细胞组,14 d后计数肺部移植瘤数目,测定外周血Treg比例。结果新鲜CD4+CD25+Treg纯度大于95%,平均96.3%±2.88%,体外扩增后纯度大于85%,平均87.73%±2.35%;与新鲜Treg相比,扩增后抑制功能未受损(P>0.05);给BALB/c小鼠注射1×106B16F10细胞后14 d肺部肿瘤结节数为(14±5)个,先注射1×107体外扩增Treg后再注射1×106B16F10细胞,肿瘤结节数增多为(73±9)个(P=0.007),与单独注射2×106B16F10细胞相当(86±8)个(P=0.230);给C57BL/6小鼠输注5×105B16F10细胞后结节数为(70±15)个,预先输入8×106体外扩增Treg后再注射5×105B16F10细胞,肺部肿瘤结节数明显增多,大于300个,与前者相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时荷瘤小鼠外周血Foxp3+Treg比例上升更为显著(P<0.05)。结论过继输注体外扩增Treg诱导移植物免疫耐受的同时,可能抑制机体的抗肿瘤免疫,因此存在一定风险。     

CIK细胞对胃癌OCUM-2MD3细胞体内外杀瘤活性的实验研究

目的：研究正常人细胞因子激活的杀伤细胞（Cytokine-induced killer,CIK)对人胃癌细胞株OCUM－2MD3的体外细胞毒活性以及对胃癌腹膜移植模型的体内抗肿瘤作用。方法：取正常人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，加入γ－IFN、IL－2、抗－CD3单抗和IL－1，体外诱导成CIK细胞，用流式细胞仪对细胞作动态表型分析，用MTT法测定CIK细胞体外对OCUM－2MD3的细胞毒活性，并与CD3AK作对比。在Balb/c裸小鼠腹腔内接种OCUM－2MD3细胞，观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。结果：CIK细胞在培养2周左右获得大量增殖，CD3^ CD56^ 双阳性细胞大量增殖达1000倍以上；体外实验证明，CIK细胞对OCUM－2MD3有明显的细胞毒活性，对比CD3AK其抑瘤率与85％与62．8％（P＜0．05）。体内实验表明，CIK细胞能够显著抑制癌性腹水的生长，其抑瘤率可达100％；肿瘤标志物CEA含量明显降低。结论：CIK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞，具有较强的体内外抗胃癌细胞活性，具有明显的抑制癌性腹水的生长的作用，有可能用于临床上晚期胃癌的过继性免疫治疗。