TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的:用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV 感染的特异性方法. 方法:采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达.用SDS-PAGE分析表达产物.表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后,得到纯度为90%的ORF蛋白抗原.用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting分析.结果:经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株. 结论:该蛋白具有良好的抗原活性.     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的 :用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原 ,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法 :采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。表达产物经Ni NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western BlotBlotting分析。结果 :经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论 :该蛋白具有良好的抗原活性     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法：采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA 柱层析纯化后,得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting。结果：经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株。结论：该蛋白具有良好的抗原活性。     

幽门螺杆菌cagA基因 PCR检测方法初探

目的 建立敏感性高的幽门螺杆菌菌株cagA基因PCR检测方法,为客观评价CagA在我国幽门螺杆菌感染致病中的作用提供基础。方法 通过分析比较GenBank中已知的cagA基因序列,设计了一对针对cagA基因保守序列,可扩增297bp片段的PCR引物,用PCR方法检测幽门螺杆菌的cagA基因,与SDS-PAGE检测CagA蛋白的结果进行比较。结果 PCR检测82株国内幽门螺菌杆菌的cagA基因,77株为cagA阳性,阳性率为93.9%,SDS-PAGE显示包括所有PCR扩增阴性菌株在内的74株幽门螺杆菌均表达CagA,阳性率为100%,PCR检测cagA基因的敏感性为93.2%。结论 建立了敏感性高的幽门螺杆菌cagA基因PCR检测方法。     

TTV部分传播途径的初步研究及西安地区TTV部分片段测序分析

目的　研究输血传播肝炎病毒 (TTV)有否直接垂直传播途径及尿液传播的可能性 ,初步了解西安地区 TTV结构部分特点 .方法　参照文献 [1]在 TTV DNA ORF1区设计一套套式 PCR引物 ,建立 TTV DNA套式 PCR检测方法 ,对 16例血清检测TTV DNA阳性的患者尿液做了 TTV DNA检测 ,对 5 2例正常顺产孕妇血清及其婴儿脐带血同时检测 TTV DNA;并且对西安地区 1例原因不明而 TTV阳性肝炎患者的 TTV套式 PCR扩增终产物纯化直接测序 .结果　 16例血清检测 TTV DNA阳性的患者尿液 TTV DNA检测未发现 1例阳性 ;在 5 2例顺产妇外周血中 ,9例 TTV DNA阳性 TTV基因检测阳性率为 17.3%(9/5 2 ) ;而新生儿脐带血 TTV基因检测阳性率为 7.7%(4 / 5 2 ) ;其中 ,母子同时 TTV DNA阳性 2例 ,单纯母亲血 TTV DNA阳性 7例 ;单纯婴儿脐带血 TTV DNA阳性 2例 .直接测序法测序 ,测得的 143bp序列用 DNAsis分析软件中国 1株 (BDH1)序列比较 ,二者同源性为 6 5 .0 %,差异率为 35 .0 %(>30 %) .结论　 TTV可能不能通过尿液传播 ,但能经胎盘直接垂直传播 ,西安地区TTV流行毒株可能存在新的 TTV基因型 .     

TTV 部分传播途径的初步研究及西安地区TTV部分片段测序分析

目的研究输血传播肝炎病毒(TTV)有否直接垂直传播途径及尿液传播的可能性,初步了解西安地区TTV结构部分特点.方法参照文献[1]在TTV DNA ORF1区设计一套套式PCR引物,建立TTV DNA套式PCR检测方法,对16例血清检测TTV DNA阳性的患者尿液做了TTV DNA检测,对52 例正常顺产孕妇血清及其婴儿脐带血同时检测TTV DNA; 并且对西安地区1例原因不明而TTV阳性肝炎患者的TTV套式PCR扩增终产物纯化直接测序.结果 16例血清检测TTV DNA阳性的患者尿液TTV DNA检测未发现1例阳性; 在52例顺产妇外周血中,9例TTV DNA阳性TTV基因检测阳性率为17.3%(9/52);而新生儿脐带血TTV基因检测阳性率为7.7%(4/52); 其中,母子同时TTV DNA阳性2 例,单纯母亲血TTV DNA 阳性7例; 单纯婴儿脐带血TTV DNA 阳性2例.直接测序法测序,测得的143bp序列用DNAsis分析软件中国1株(BDH1)序列比较,二者同源性为65.0%,差异率为35.0%(>30%).结论 TTV可能不能通过尿液传播,但能经胎盘直接垂直传播, 西安地区TTV流行毒株可能存在新的TTV基因型.     

青海省少数民族地区TT病毒（TTV）分子流行病学研究

目的 :探索青海省少数民族人群间TTV感染状况并进行分子流行病学调查 ;方法 :应用酶联免疫试验、聚合酶链反应 (PCR)技术的方法 ,检测 3个民族血清 ,测序分析一株藏族毒株DNA基因 ;结果 :1 56份血清排除HBV、HCV、HGV感染 ,TTV -IgG阳性率藏族 1 4.9% ;蒙古族 1 .9% ;土族未能测到阳性 ;1 3例TTV阳性血清经PCR检测TTVDNA阳性率 53 .8% ( 7/ 1 3 ) ,70 0个核苷酸分析与BDH1 及型的比较同源性为 90 %以上 ,同属G1a亚型 ;结论 :TTV在少数民族人群有感染性 ,不同民族和地域有显著差异 ( χ2 =7.53 ,P <0 .0 1 ) ,提示有外源性不同途径输入性感染的特征     

50例慢性非甲-庚型肝病患者中TTV的感染状况及部分序列的基因分析

目的:探讨新型肝炎相关病毒(TTV)在慢性非甲-庚型肝病患者中的感染状况,分析国内病毒的基因结构特点.方法:根据国内外报道的部分基因序列,自行设计特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)法检测了50例慢性非甲-庚型肝病患者,并对阳性标本克隆后进行序列分析.结果:慢性非甲-庚型肝病患者中TTV感染率为52%,对TTV病毒株进行序列分析发现与N22克隆同源性可达97.8%.结论:我国也存在严重的TTV感染,TTV可能为慢性非甲-庚型肝病的致病因子.我国TTV感染株与国外报道的N22克隆有高度同源性.     

长沙地区献血员血清TT病毒DNA检测及核苷酸序列分析

目的 :了解长沙地区献血员输血传播病毒 (TTV)感染情况 ,初步探讨该病毒感染与肝炎的关系。方法 :根据己报道的TTV基因保守序列 ,设计两对引物以套式聚合酶链反应 (nested PCR)对 1 82份献血员血清标本进行TTVDNA检测。结果 :45份单纯ALT升高血清标本TTV阳性 1 6例 (3 5 6%) ,1 2 9份ALT正常血清标本TTV阳性 2 1例 (1 6 3 %)。ALT升高组TTVDNA的阳性率明显高于ALT正常组 (x2 =7 40 ,P <0 0 5)。序列分析结果显示 ,献血员TTV分离株相应位置核苷酸序列与日本株和中国株的同源性≥ 97 1 %。结论 :长沙地区献血员中TTV感染率较高 ,TTV感染与肝炎密切相关 ;长沙地区分离的TTV可能与日本株AB0 0 83 94和中国株AF0 791 73属同一基因型。     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

青岛地区TTV抗体阳性人群的病毒基因检测及序列分析

（1）目的 了解经血传播病毒（TTV）在青岛地区的基因变异情况。（2）方法 选择TTV抗体阳性的标本,用巢式PCR技术扩增血清中的DNA特定片段,纯化后与载体连接并转入大肠杆菌JM109,提取阳性克隆的重组质粒测序并与TTV的已知序列相比较。（3）结果 在选择的20例标本中,15例扩增出TTV DNA,对其中1株测序后与已知序列AB008394比较,发现碱基变异率为13．3％。（4）结论 青岛地区存在TTV变异株。     

对山东地区TTV基因片段的检测及其部分核酸序列测定

目的 了解山东地区输血传播病毒（TTV）分离株感染状况及基因变异的情况。方法 应用逆转录－聚合酶链反应法（RT－PCR）检测山东地区26例非甲－戊型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中的TTV DNA，对阳性扩增的产物进行测序，并分析其基因变异情况。结果 26例非甲－戊型肝炎患者检出TTV DNA阳性者11例（42％）。对其中2例（TTVSD4，TTVSD5）进行PCR产物直接测序，并与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性分别为99．9％和100％。而12例肝细胞癌患者中TTVDNA阳性3例（25％），对其中1例（TTVSD6）测序，与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性为99％；TTVSD1、TTVSD5和TTVSD6之间的核苷酸同源性均为99％。结论 山东地区非甲－戊型肝炎和肝细胞癌患者中TTV感染率较高，测序结果表明其与日本株（AB008394）有较高的同源性。     

梅毒螺旋体青霉素结合蛋白的克隆及表达

目的体外克隆并表达梅毒螺旋体青霉素结合蛋白，为制备预防性疫苗奠定基础。方法利用PCR反应及基因重组技术，扩增重编码青霉素结合蛋白的基因，构建重组质粒pETJKM／TpN47，IPTG诱导表达。结果PCR法扩增出了1350bp的目的片段，原核表达质粒pETJKM／TpN47酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。结论成功构建了人pETJKM／TpN47原核表达载体，高效表达了青霉素结合蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的：克隆及表达人黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法：从人急性髓细胞白血病细胞系HL-60提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM-T-easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建高效表达克隆，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmoL／L异丙基-β—D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，PRAME蛋白表达即达高峰。结论：PRAME基因在极少数正常组织中低表达，而在白血病患者高表达，并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原，所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析

目的：构建旋毛虫河南成囊前期幼虫编码相对分子质量为31000的蛋白原结构基因（TspE1）的重组质粒（pUC18－TspE1)，测定TspE1基因序列，分析旋毛虫河南株的基因多态性。方法：根据TspE1基因已知序设计合成一对引物，采用RT－PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因，PCR产物经纯化后用BamHI、HindⅢ进行双酶切，定向克隆入pUC18质粒，转化在肠杆菌JM109；重组质粒用BamHI＋HindⅢ酶切有PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行了DNA序列测定，应用DNASIS软件进行同源性比较。结果：RT－PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因（871bp），EcoRI酶鉴定正确；筛选出7个阳性克隆，对目的基因的测序结果显示旋毛虫河南株TspE1基因有5种类型，但都与GenBank中的TspE1基因序列及其由其推测的氨基酸序列不完全相同。结论：应用RT－PCR技术手增出旋毛虫河南株成囊前期成幼虫编码相对分子质量为31000的抗原结构基因，证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达，结果还提示旋毛虫河南株可能存在有基因多态性。     

人疱疹病毒6型101K被膜蛋白主要抗原决定簇区原核表达克隆的构建和表达

目的构建人疱疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV-6B 101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2 347~2 853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV-6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHis A分别经双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,应用PCR法及限制性核酸内切酶双重鉴定原核表达质粒,并经测序证实。IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白。结果PCR获得的目的基因序列与GenBank中HHV-6B标准毒株Z29序列一致,重组质粒诱导菌表达产物出现相对分子质量为31 900的融合蛋白条带。结论HHV-6 101K蛋白的原核表达克隆构建和表达成功,为进一步完善HHV-6活动性感染的血清学诊断提供了实验基础。     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.