His 标记 STAT4(565-748 氨基酸)肽段融合蛋白原核表达及纯化

目的:构建His 标记的人STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR 扩增编码STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a 原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵体变性、复性、树脂纯化、透析。免疫印迹鉴定纯化的融合蛋白。结果:PCR 扩增获得目的片段,克隆到pET-28a,转化感受态细胞,IPTG诱导发现融合蛋白存在于包涵体。经变性、复性、树脂纯化和透析,免疫印迹实验发现融合蛋白表达、被纯化。结论:成功构建人STAT4(565-748aa)肽段原核表达质粒并获纯化融合蛋白。     

人源鼻咽癌双价抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定

目的:构建全人源鼻咽癌双价抗独特型抗体原核表达载体,并对其产物作初步鉴定。方法:利用分子克隆技术依次将G22,I50插入到原核表达载体pET25b(+)中,经菌落PCR,双酶切验证并测序。阳性重组子转化入表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后,表达的重组蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。用Westernblot方法鉴定G22-I50双价蛋白的表达,ELISA方法分析其蛋白活性,并进一步观察其对外周血单个核细胞的刺激增殖情况。结果:构建的原核表达载体pET25b-G22-I50经测序验证,序列正确。双价蛋白G22-I50以包涵体形式高效表达,经纯化后纯度达90%以上。Westernblot鉴定表达的蛋白相对分子质量(Mr)约42000,与预期相符。ELISA鉴定复性后的蛋白已恢复活性,并能在体外刺激外周血单个核细胞的增殖。结论:成功获得了有活性的双价抗独特型抗体,为临床对鼻咽癌进行主动免疫治疗提供了理论基础。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24的构建、表达和体外活性研究

目的构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法利用PCR技术将GRGDS序列融合至hIL-24的N端,并将融合基因连接至表达载体pET-22b后,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行表达。亲和层析法纯化RGD-hIL-24,复性后采用MTT比色法、荧光染色分析其体外抗肿瘤活性,并通过细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。结果获得RGD-hIL-24基因,序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot证明融合基因在大肠杆菌表达相对分子质量(Mr)约为20×103的RGD-hIL-24,占全菌蛋白的26．47％,主要以包涵体形式存在。纯化后的蛋白纯度达90％以上。复性后的RGD-hIL-24能够诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,显著抑制其生长,并具有肿瘤靶向性。结论大肠杆菌成功表达RGD-hIL-24融合蛋白,体外实验证实RGD-hIL-24具有显著的抗肿瘤活性和肿瘤靶向性,为其在体内抗肿瘤效应和靶向性研究奠定了基础。     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响。目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用。方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过KpnI和SalI插入到原核表达载体pET32a(+)中。经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析;以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响。结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中。通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Westernblot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力。MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移。成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测

目的对铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列进行改造,以获得相对分子质量小、活性强的重组毒素PE38KDEL。方法基于铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列的高GC含量,通过PCR反应和酶切技术,构建重组毒素PE38KDEL基因,并于大肠杆菌表达,用Westernblot分析表达产物。为检测其生物活性,将其与靶向分子IL4突变体cpIL4(13D)融合,构建融合蛋白表达载体,并于大肠杆菌表达,表达产物经亲和色谱和阴离子交换色谱纯化后,用MTT法检测其对表达IL4受体的黑色素瘤细胞LiBr的细胞毒性。结果成功构建了PE38KDEL基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,表达量占细胞全蛋白的21%左右;构建了融合蛋白cpIL4(13D)PE38KDEL,并于大肠杆菌AD494(DE3)中得到高效表达,纯化后融合蛋白的纯度达95%以上,细胞毒实验证明其对黑色素瘤细胞LiBr具有良好的杀伤作用,这说明改造后的PE38KDEL是具有细胞毒效应的。结论重组毒素PE38KDEL的构建,为各种导向药物的构建奠定了基础。     

重组人sCD40L-IZ基因的克隆、原核表达及重组三聚体蛋白的鉴定

目的:克隆并表达有生物学活性的CD40配体(CD40ligand,CD40L)重组蛋白。方法:应用PCR技术克隆CD40L胞外功能区(E107-L261)基因,并在其N端融合异亮氨酸拉链(isoleucinezipper,IZ)促使其形成三聚体活性形式,同时为了后期纯化的需要,在IZ的N端融合6个His,将所融合得到的sCD40L-IZ克隆进入pET30a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果:重组蛋白sCD40L-IZ以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达95%以上的sCD40L-IZ重组蛋白。经凝胶过滤层析和非还原SDS-PAGE分析验证了其确有三聚体形式。激光共聚焦实验结果表明,重组蛋白sCD40L-IZ可与骨髓瘤细胞株XG2表面CD40分子结合,并促使其在膜表面发生聚集。结论:人sCD40L-IZ重组蛋白在大肠杆菌体系得以成功表达,并以三聚体活性形式发挥功能,为今后进一步研究其与凋亡、疾病发病机制的关系及其在临床治疗中的应用奠定了基础。     

凋亡素原核表达载体构建及活性测定

背景：体外合成或通过基因工程表达的凋亡素Apoptin 是一种可以特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对人体正常细胞无毒性和转化活性的蛋白,为抑制肿瘤的生长提供可能。 目的：构建凋亡素基因的原核表达载体,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测纯化所得目的蛋白的活性。 方法：将已构建好的凋亡素基因亚克隆至原核表达载体 pET-28b(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli宿主菌中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析目的蛋白,并检测所表达的目的蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用。 结果与结论：凋亡素基因被成功的克隆至 pET-28b(+),在26 ℃、IPTG 0.5 mmol/L诱导8 h的情况下,Apoptin为包涵体表达,表达产物经 SDS-PAGE 分析,在相对分子质量约15 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,经变复性和亲和层析纯化后,获得高纯度目的蛋白,进一步检测发现其对肺癌细胞H460及H1299具有一定的促凋亡作用。实验成功构建了凋亡素原核表达载体PET-28b-Apoptin,获得了具有一定生物活性的目的蛋白,为进一步研究凋亡素的功能和开发其应用价值研究奠定了基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。