转移生长因子β1对体外培养破骨细胞功能影响的实验研究

目的探讨转移生长因子β1(TGF-β1)对体外培养破骨细胞功能影响的机制.方法酶动力学法测定培养基中酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性;共聚焦激光扫描显微镜观察体外培养破骨细胞内氢离子随TGF-β1浓度的变化情况;Leica Quantimet 500图像分析系统对骨吸收陷窝进行图像分析;扫描电镜观察骨吸收陷窝变化.结果随着TGF-β1浓度的升高,处理组与对照组ACP和TRAP的活性分别从(1.71±0.33U)/L和(1.41±0.29)U/L降低到(1.32±0.21)U/L和(1.01±0.11)U/L(均为P＜0.01),骨吸收陷窝的数目与面积从(16.67±1.35)个/片和(582.24±178.68)μm2减少到(13.29±1.47)个/片与(442.38±148.27)μm2,处理组与对照组比较差异具有显著性(P＜0.01).破骨细胞相对荧光值无显著性差异,表明TGF-β1对体外培养破骨细胞分泌H+无明显影响.结论TGF-β1虽然不能抑制氢离子释放,但能通过改变酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性,进而直接抑制体外培养破骨细胞的骨吸收功能.     

体外培养的破骨细胞细胞化学测量观察

本文采用Spraque-Dawloy大鼠体外破骨细胞培养及新鲜长骨组织破骨细胞印片方洼研究两种材料中破骨细胞细胞化学的异同，检测了酸性磷酸酶(AcP)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、β-酸性半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、NADH和NADPH脱氢酶．并使用Zeiss氏细胞扫描显微镜连接CD／MD20电脑图像分析系统，定量检测了以上酶的活性。结果表明，大鼠体外培养和新鲜组织印片的破骨细胞含有丰富的多种溶酶体酶和厌氧脱氢酶(线粒体酶)，新鲜组织印片的破骨细胞大多数脱氢酶的活性高于体外培养的破骨细胞。     

高度糖基化终产物对破骨细胞酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响

目的：观察高度糖基化终产物（AGE）对破骨细胞酸性磷酸酶（ACP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性的影响。方法：用人血清白蛋白和葡萄糖恒温孵育制备人AGE蛋白，应用酶消化法从人髂骨松质骨分离培养破骨细胞。将AGE蛋白与培养的破骨细胞共同孵育，通过酶动力学法测定培养液ACP和TRACP活性，结果：低浓度AGE蛋白（50－200μg/ml）对破骨细胞ACP和TRACP活性无显著，而高浓度（500－1000μg/ml）则使ACP和TRACP活性显著增高，且ACP活性的增高主要来自TRACP活性的增高。结论：上述结果提示AGE蛋白可能促进破骨细胞的破骨功能。     

骨细胞对破骨细胞形成和功能的影响

破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞骨形成作用的交替进行维持了骨量的平衡。破骨细胞可以选择性吸收损伤部位的骨质,其激活和定位机制目前还未阐明。近年来的研究认为骨细胞是感知骨环境的基本单位,而且骨细胞还可以将所感知的信号传递给其它骨细胞,骨衬细胞,成骨细胞及破骨细胞等。对骨细胞和破骨细胞的研究中发现骨细胞可能在破骨细胞的激活和定位中起到了重要的作用,但是具体机制还有待研究。     

l，25(OH)2D3诱导鼠骨髓细胞形成多核破骨细胞的实验研究

目的：观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对骨髓干细胞形成破骨细胞的调控作用，从而为破骨细胞骨吸收机制的研究奠定方法学的基础。方法：将不同浓度１，２５（ＯＨ）２Ｄ３加入原代培养的刀骨髓细胞培养液中，利用抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色，监测不同时间点破骨细胞的形成情况，利用倒置光相差异微镜和扫描电镜检测所诱导形成破骨细胞的骨吸收功能情况。结果：培养前３天，细胞ＴＲＡＰ染色阴性，第４天出现ＴＲＡＰ阳性单核细     

血小板衍生生长因子－BB对破骨细胞功能影响的实验研究

目的探讨血小板衍生生长因子 -BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB,PDGF -BB)对破骨细胞生物学功能的影响。方法 (1)利用酶消化法分离培养成人破骨细胞 ;(2)应用透射电子显微镜方法观察破骨细胞对PDGF -β 受体的表达 ;(3)在经过纯化的破骨细胞上清液中施加重组人基因PDGF -BB ,利用酶动力学方法测定培养上清液中的酸性磷酸酶 (ACP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性 ;(4)通过Leica图像分析仪观察在PDGF -BB作用下 ,破骨细胞所形成骨吸收陷窝的数目与面积。结果 (1)破骨细胞膜上有胶体金颗粒沉着 ;(2)破骨细胞培养上清液中的ACP和TRAP活性随着PDGF -BB浓度的升高而增加 ,分别从(1.85±0.13)u/L和(1.73±0.15)u/L(对照组 )增加至(2.86±0.15)u/L和(2.75±0.24)u/L(40μg/L组 ,P<0.01) ;(3)在PDGF -BB的作用下 ,破骨细胞所形成的骨吸收陷窝的面积从(435.08±237.50)μm2(对照组 )增高至(630.26±240.64)μm2 (40μg/L组 ,P<0.01) ,每个骨片上骨吸收陷窝的数目亦从14.00±1.41增加为26.00±2.00(P<0.05或P<0.01)。结论PDGF -BB通过与PDGF -β受体结合 ,可直接促进破骨细胞的骨吸收功能     

Genistein对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响及其机制探讨

目的 探讨三羟异黄酮类药Genistein对破骨细胞性骨吸收的作用及其机制。方法 1，25(OH)2D3诱导小鼠骨髓细胞形成破骨样细胞，分别加入0moL／L、10^-9moL／L、10～moL／L、10^-7moL／L、10～moL／L、10^-5moL／LGenistein，于培养3，5和8d分别计数抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞个数；于培养12d利用图像分析系统对骨吸收陷窝的面积进行测量分析。另从小鼠颅盖骨分离培养获得原代成骨细胞，分别加入0，10^-8，10^-7，10^-6和10^-5moL／LGenistein并以10^-9moL／L^-7 β雌二醇为对照，采用RT-PCR的方法检测Genistein对骨保护因子(osteoprotegerin，OPG)及破骨细胞分化因子(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)mRNA表达的影响。结果 利用1，25(OH)2D3成功诱导出破骨样细胞；随Genistein浓度增加，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞(单核、双核和多核)个数和骨吸收陷窝面积呈剂量依赖性减少。同时，应用Genistein后原代成骨细胞中OPG和RANKL的mRAN表达都有增强，但其最终效应表现为剂量依赖性和时间依赖性地增大OPG／RANKL的浓度比。结论 Genistein通过抑制破骨前体细胞分化来抑制其体外骨吸收功能，其分子机制与OPG／RANKL mRNA表达比值的升高有关。     

脉冲电磁场对大鼠破骨细胞功能分子的影响

目的研究脉冲电磁场(puslsed electromagnetic fields,PEMFs)对大鼠破骨细胞的作用。方法取10w龄雌性SD大鼠随机分为三组:PEMFs组、Control组和Sham组;其中PEMFs组、Control组进行双侧卵巢切除手术,Sham组不切除卵巢。术后12w对PEMFs组大鼠进行PEMFs作用(70Hz,2mT),Control组和Sham组不进行PEMFs作用。作用结束后,取大鼠股骨骨髓,进行体外破骨细胞诱导培养。7天后分别进行破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)检测和整合素αvβ3、NF-κB受体激活子(receptor activator of NF-κB,RANK)、组织蛋白酶K(cathepsin K)免疫荧光染色检测。结果经PEMFs作用后,TRAP检测显示破骨细胞形态;免疫荧光染色显示阳性破骨细胞也明显减少。结论 PEMFs对破骨细胞功能分子的表达有抑制作用,提示PEMFs作用可以抑制SD大鼠破骨细胞的骨吸收活性。     

补肾益骨方对去卵巢大鼠骨质疏松症治疗作用的研究

目的 探讨中药补肾益骨方对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用.方法 运用切除大鼠卵巢方法 建立去卵巢骨质疏松症模型,随机分为空白对照组、模型组、倍美力组、补肾益骨方组.采用双能X线骨密度测定法检测各组实验鼠骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC);放射免疫分析法和ELISA法等检测各组实验鼠血清雌二醇(E2)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b) 和以及尿脱氧吡啶啉(Dpd).结果 补肾益骨方可明显升高 BMD、BMC,提高血清E2及BGP水平,降低TRACP5b和Dpd含量.结论 补肾益骨方通过调节机体相关内分泌功能,抑制骨吸收,降低骨的转换率,减少骨量丢失,增加骨密度,对骨质疏松症有防治作用.     

蛋白酪氨酸磷酸酶调节破骨细胞活性的作用

蛋白酪氨酸磷酸酶对破骨细胞活性具有重要的调节作用。与破骨细胞相关的,能够使c-SrcPY527去磷酸化起到关键作用的PTPs有:SHP-1、胞质PTP-ε、PTP-PEST以及PTP-oc。其中SHP-1对破骨细胞进行负调节,其它三种为正向调节。     

流体剪切力对破骨细胞的影响

骨组织受到成骨细胞成骨作用和破骨细胞溶骨作用共同影响。与成骨细胞和骨细胞不同,破骨细胞起源于造血干细胞,由单核巨噬细胞发育而来,具有吞噬功能,能对多种刺激因素产生效应,其中机械刺激是始终存在的影响方式。机械刺激诱导的成骨细胞的正性调节对于骨生成、骨修复有至关重要的作用,而破骨细胞在这些方面的效应也十分关键。流体剪切力作为骨组织内机械刺激的一种常见形式,作用于成骨细胞和骨细胞的时候,通过对Ca2+、前列腺素、NO、RANKL和OPG等信号因子的影响,表现出介导破骨细胞迁移、分化、吸收和生存维持等现象的功能,这承载了骨代谢必不可少的一部分。同时这些因子相互交错,表现出复杂信息网络及阶段特异性。但总的来说,人们对流体剪切力调节破骨细胞生理及病理功能具体信号传导的了解还不是很深入,需要用更多的研究来阐明流体剪切力和破骨细胞之间的关系。本文就流体剪切力对破骨细胞相关分子信号影响做一综述,简要展示流体剪切力影响破骨细胞的相关机理。     

芒柄花素抑制RANKL诱导破骨细胞分化的实验研究

目的:建立RANKL诱导的破骨细胞体外研究模型,阐述活血化瘀中药鸡血藤有效组分芒柄花素(formononetin,FO)调控小鼠骨髓单核-巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化和功能的影响,探讨其抑制破骨细胞分化的分子机制。方法:取20只4~6周龄清洁级C57/BL6小鼠,雌雄各10只,体重(20±2)g,无菌条件下分离出股骨和胫骨内BMMs,用α-MEM培养基进行体外培养和增殖。BMMs在加入M-CSF和不同浓度的芒柄花素(5~50?滋M)分别培养4 d后进行细胞增殖与毒性的CCK8检测。将生长状态良好的BMMs依次加入M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化,对照组无特殊处理,DMSO对照组加入DMSO溶剂,各观察组分别加入不同浓度芒柄花素(1~20?滋M),分别进行培养6 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,对破骨细胞的进行计数和统计分析。分别在破骨细胞培养的1、2 d收取总蛋白和磷酸化蛋白,Western blot检测破骨细胞分化中关键转录因子NFATc1和c-Fos的表达以及磷酸化蛋白ERK表达;在培养的4 d提取RNA,Real-Time PCR检测破骨细胞相关基因CTSK、TRAP、MMP9和Car2的活性。结果:CCK8检测结果提示芒柄花素能够剂量依赖性地抑制BMMs的活性,在≤20?滋M的安全浓度范围内对BMMs细胞生长无明显毒性效应(P=0.278>0.05)。TRAP染色结果发现芒柄花素在(1~20?滋M)浓度范围内能够剂量依赖性的抑制破骨细胞的生成,尤其是10?滋M能够显著抑制破骨细胞的生成(P=0.000<0.05)。Western blot检测表明芒柄花素(10?滋M)能显著抑制破骨细胞分化关键蛋白NFATc1和c-Fos的表达,而对磷酸化蛋白ERK的表达未见明显的作用。在破骨细胞功能上,Real-Time PCR检测芒柄花素(10?滋M)能著抑制破骨细胞功能相关基因CTSK(P=0.000<0.05)、TRAP(P=0.000<0.05)、MMP9(P=0.000<0.05)和Car2(P=0.000<0.05)的表达。结论:鸡血藤有效组分芒柄花素能够抑制原代骨髓单核-巨噬细胞向破骨细胞增殖和分化,并下调破骨细胞骨吸收功能相关蛋白和基因的表达,可能是其防治股骨头坏死中骨破坏及塌陷的机制之一。     

蛇床子素对体外培养大鼠股骨组织吸收的抑制作用

目的:研究蛇床子素(Osthole,OS)对体外培养股骨组织(骨干和骨骺端)吸收活性的影响.方法:取(80±5)g雄性SD大鼠6只,体外分离培养大鼠股骨组织的骨干和骨骺端,随机分为对照组、雌二醇组(estradiol,E)和蛇床子素处理组.同时在股骨组织分离培养48 h后采用终浓度为1×10^-5 mol/L的蛇床子素和1×10^-8 mol/L雌二醇对体外培养骨干和骨骺端进行处理;分别在药物处理后的第3、6、9、12 天后测定抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,StrACP)活性、培养基中葡萄糖(Glucose,Glu)、乳酸(Lactic acid,La)的含量、Real-Time RT-PCR StrACP、集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,MCSF)、组织激酶K(Cathepsin K,CTSK)mRNA的表达水平.结果:1×10^-5 mol/L蛇床子素组碱性磷酸酶(ALP)活性为2226,1×10^-8 mol/L雌二醇组ALP活性为2498;与对照组比较1×10^-5 mol/L蛇床子素和1×10^-8 mol/L雌二醇组在加药处理后的第6、9和12天显着抑制StrACP酶活性(P<0.05);1×10^-5 mol/L蛇床子素处理体外培养大鼠骨骺端和骨干组织的第3、6、9天后显着增加培养基中乳酸含量(P<0.05),并显着减少培养基中葡萄糖的含量(P<0.05).与对照组比较,1×10^-5 mol/L的蛇床子素处理体外培养大鼠股骨组织后的第6和9天蛇床子素能显着抑制StrACP,MCSF,CTSK mRNA的表达水平(P<0.05).结论:蛇床子素抑制体外培养大鼠股骨组织的骨骺端和骨干吸收活性同时可提高营养代谢水平.     

RANKL诱导小鼠单核细胞RAW264.7分化成成熟破骨细胞

目的观察小鼠的单核／巨噬细胞RAW264．7的一般生物学特征及在RANKL诱导下形成成熟破骨细胞的特征。方法RANKI，诱导RAW264．7细胞6d后，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞，吖啶橙染色激光共聚焦显微镜(LCSM)观察多核细胞形态；诱导RAW264．7细胞9d后，RT、PCR检测RAW264．7细胞的破骨细胞表型和功能基因表达及其RANKL诱导后变化；诱导RAW264．7细胞12d后，钙磷覆盖的破骨细胞活性分析板观察破骨细胞的骨吸收功能。结果RAW264．7细胞TRAP染色阴性，单核或2个核，能表达破骨细胞表型和功能基因，无骨吸收功能。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成TRAP阳性成熟的多核破骨细胞，上调CathepsinK、CAⅡ、integrinβ3等基因mRNA的表达。结论RAW264．7具有破骨细胞特征性基因表达谱，是一种较好的破骨前体细胞模型。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成成熟破骨细胞。     

脉冲磁场对成骨细胞和破骨细胞的影响

近年来,脉冲磁场(PEMFs,pulsed electromagnetic fields)在骨质疏松治疗中已得到广泛的关注。PEMFs对参与骨重建的成骨细胞和破骨细胞都有显著影响。本文从PEMFs及其对骨质疏松的影响、PEMFs对成骨细胞和破骨细胞的影响以及可能机制方面加以综述。     

健骨方对破骨细胞形成和成骨细胞增殖分化的影响

目的　探讨健骨方水提物对破骨细胞分化及成骨细胞增殖分化的影响。方法　制备健骨方水提物,通过MTT法测定药物对骨髓单核巨噬细胞（BMMs）细胞的毒性,采用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导BMMs分化形成破骨细胞,加入不同浓度药物进行干预,采用抗酒石酸酸性磷酸酶( TRACP) 染色法测定破骨细胞分化抑制作用,采用Western Blot 法测定RANKL诱导的NF-κB破骨细胞分化信号通路,运用RT-qPCR法测定信号通路下游破骨细胞分化关键基因NFATc1、C-FOS等的mRNA表达水平。以MC3T3-E1细胞作为前体成骨细胞,加入不同浓度药物进行干预,通过CCK8法测定细胞增殖能力、PNPP法检测碱性磷酸酶（ALP）活性、茜素红S染色法测定细胞矿化能力。结果　MTT法结果显示,健骨方细胞有毒性浓度大于500 μg/mL（P＜0.05）,破骨细胞分化抑制IC50为1.25 μg/mL。机制研究显示健骨方显著下调了RANKL-NF-κB信号通路中的p-P65、P53的蛋白表达（P＜0.05）,显著抑制了通路下游C-FOS、NFATc1等的mRNA表达水平（P＜0.01,P＜0.05）。此外,成骨细胞活性检测显示,健骨方能明显促进MC3T3-E1细胞增殖、提高ALP活性及增加成骨细胞钙化的能力。结论 健骨方具有抑制破骨细胞分化和促进成骨前体细胞增殖、分化、矿化的药效作用。其作用与抑制破骨细胞分化RANKL-NF-κB信号通路及其下游C-FOS、NFATc1等基因,上调成骨细胞分化促进因子CAL1A2、SPARC和FOSL1基因的表达有关。     

辛伐他汀对钛颗粒刺激人单核细胞形成破骨细胞的影响

目的研究体外辛伐他汀对钛颗粒刺激单核细胞形成破骨细胞的影响,探讨辛伐他汀防治人工关节无菌性松动的可能性。方法体外分离培养人外周血单个核细胞并分成5组,A组为钛颗粒刺激组（单核细胞和磨屑混合培养）,B组为10^-5mol／L辛伐他汀组（单核细胞、磨屑混合培养＋10^-5mol／L辛伐他汀）,C组为10^-6mol／L辛伐他汀组（单核细胞、磨屑混合培养＋10^-6mol／L辛伐他汀）,D组为10^-7mol／L辛伐他汀组（单核细胞、磨屑混合培养＋10^-7mol／L辛伐他汀）,E组为单核细胞组。各组细胞培养24h后取上清液,用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的含量。分别培养10d、18d后进行TRAP染色阳性细胞计数,采用扫描电镜检测骨磨片的吸收陷窝,观察钛颗粒对破骨细胞形成的影响。结果磨屑刺激单个核细胞分泌溶骨因子,辛伐他汀抑制磨损颗粒刺激单核／巨噬细胞分泌TNF-α及MCP-1;且破骨细胞数明显减少,骨吸收陷窝数减少,与钛颗粒组刺激组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论辛伐他汀通过抑制TNF-α、MCP-1的释放而有效防止磨屑诱导的骨溶解,有望成为防治人工关节无菌性松动的一种有潜力的药物。     

骨代谢指标在老年骨质疏松性骨折后变化的临床应用

目的 通过测定老年骨质疏松患者骨折后骨代谢生化指标,揭示骨代谢指标在老年骨折患者中的变化规律,提供早期控制老年骨质疏松性骨折后骨吸收的依据,有利于加强骨形成的能力,缩短骨折愈合时间,防止再次骨折及并发症的发生.方法 对82例(男33例,女49例)60岁以上髋部骨折及椎体压缩骨折患者和61例(男29例,女32例)老年健康对照组进行血清骨特异性碱性磷酸酶(Serum Bone Alkaline Phosphates,BALP)、骨钙素(bone gla-containing protein BGP)和血清抗洒石酸酸性磷酸酶5b(tart rate-resistant acid phosphates isoform-5b)测定.结果 (1)老年骨质疏松性骨折患者中TRACP-5b水平明显高于对照组(P<0.001),且女性骨转换高于男性;老年骨质疏松骨折患者BALP水平高于正常组(P<0.01).(2)骨折后骨转换指标(BAP,TRACP-5b)与骨密度呈负相关.结论 骨折后患者骨吸收增加,女性骨转换高于男性,女件骨折后更加重骨质疏松,不利于骨折后愈合,而骨折后监测骨代谢指标,提供早期控制骨吸收的依据,女性更应长期监测骨代谢并抗骨吸收治疗,利于加强骨形成的能力,缩短患者卧床时间,防止再次骨折及并发症.