二甲双胍对胰岛素抵抗状态的小鼠胚胎成纤维细胞中腺苷酸活化蛋白激酶及葡萄糖转运子4表达的影响

目的 观察二甲双胍对IR状态的小鼠胚胎成纤维（3T3-L1）细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及葡萄糖转运子4（GluT4） mRNA表达的影响. 方法 诱导分化3T3-L1前脂肪细胞为成熟脂肪细胞并用油红O染色证明.用地塞米松诱导建立3T3-L1细胞IR模型,以葡萄糖氧化酶法测定不同时段细胞培养基中剩余葡萄糖浓度,以确定IR模型的建立.给予二甲双胍进行药物干预后,测定细胞培养基中剩余葡萄糖浓度并运用实时荧光定量PCR技术检测细胞AMPK和GluT4的mRNA基因水平.结果 药物干预组给予不同浓度二甲双胍后,细胞培养基中剩余葡萄糖浓度均较模型组降低（P＜0.01）.药物干预组AMPK、GluT4 mRNA水平较模型组均增加（P＜0.01）. 结论 二甲双胍上调处于IR状态的3T3-L1细胞中AMPK和GluT4 mRNA水平,增加细胞对葡萄糖利用.     

二甲双胍作用于3T3-L1前脂肪细胞诱导阶段对v-SNAREs蛋白家族mRNA表达的影响

目的 观察3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中二甲双胍对囊泡相关膜蛋白(VAMPs)mRNA表达变化,探讨二甲双胍促进葡萄糖转运子4(GLUT4)转运中的作用机制。方法 在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中,分别持续给予不同浓度的二甲双胍(0、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L)干预12d后,比较不同浓度的二甲双胍对AMPK、GLUT4及VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7、VAMP8的mRNA水平。结果 与0mmol/L组相比,0.5mmol/L组GLUT4、VAMP2、VAMP3、VAMP8mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与0mmol/L组相比,1mmol/L组上调GLUT4、VAMP2、VAMP3、VAMP8mRNA水平升高(P<0.05);与1mmol/L组相比,2mmol/L组下调GLUT4及VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8mRNA表达水平(P<0.05)。各组间AMPK1、VAMP4、VAMP7的mRNA表达水平比较差异无统计学意义。结论 二甲双胍可以作用于前脂肪细胞的诱导分化过程,且呈剂量依赖性地上调脂肪细胞中GLUT4及VAMP2、VAMP3、VAMP8mRNA的表达。     

高尿酸诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗及其机制的研究

目的探究高尿酸血症(HUA)对3T3-L1脂肪细胞IR的影响,并且探讨其分子机制。方法 3T3-L1脂肪细胞先经不同浓度UA单独预处理或与N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)共同预处理后再接受胰岛素刺激,采用CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞活力,采用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,采用Western blot检测IRS-1和Akt蛋白磷酸化水平及GluT4蛋白水平。结果 HUA可抑制胰岛素诱导的葡萄糖消耗、Akt磷酸化(Thr308)和IRS-1去磷酸化(Ser307),以及GluT4蛋白表达(P0.05),这些作用可被NAC可阻断(P0.05)。结论 HUA可抑制胰岛素激活的IRS-1/Akt信号通路和GluT4蛋白表达,导致3T3-L1脂肪细胞发生IR。     

软脂酸制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的方法

目的 用软脂酸(PA)诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨用PA制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型的方法.方法 将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用油红O染色法鉴定细胞.用不同浓度的PA(0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5mmol/L、1.0 mmol/L)干预3T3-L1脂肪细胞24 h,收集各组细胞培养液,用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量,观察PA对3T3-L1脂肪细胞糖摄取的影响.结果 0.25 mmol/L PA就可明显抑制成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取(P＜0.01),且呈浓度依赖性.与对照组相比,0.25 mmol/L PA组、0.5 mmol/L PA组、1.0 mmol/L PA组葡萄糖摄取率分别下降5.25％、10.29％、14.54％.结论 在胰岛素刺激下,0.25 mmol/L PA作用于3T3-L1脂肪细胞24 h就可诱导细胞产生IR,且随着浓度的增加其效果逐渐增强.     

外源性硫化氢对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖转运体4表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的影响,并探讨其机制。方法用高糖高胰岛素培养3T3-L1脂肪细胞,建立IR细胞模型,外源性H2S供体NaHS(10-5、10-4和10-3mol/L)处理IR 3T3-L1细胞12、24和48 h。MTT法检测细胞活力,葡萄糖氧化酶法检测培养液中的葡萄糖消耗量,2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄取。实时定量PCR和Western blot检测葡萄糖转运体4(Glut4)的表达。结果与对照组比较,IR模型组细胞葡萄糖消耗和摄取量以及Glut4 mRNA和蛋白的表达显著降低(均为P<0.05)。与对照组比较,所有浓度的NaHS均未影响细胞活力。与IR模型组比较,NaHS(10-4和10-3mol/L)处理24和48 h显著增加细胞葡萄糖消耗和摄取量以及Glut4 mRNA和蛋白的表达(均P<0.05)。结论外源性H2S改善了高糖高胰岛素诱导的脂肪细胞的IR,其机制可能与H2S上调Glut4的表达有关。     

脂联素球状结构域对胰岛素抵抗模型脂肪细胞及胰岛素信号转导的影响

将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用软脂酸制备脂肪细胞胰岛素抵抗模型,不同浓度的脂联素球状结构域(globular domain of adiponectin,gAd)干预已经产生胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞,葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖的消耗量,实时荧光定量PCR法检测胰岛素受体底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB)基因水平的变化,Western印迹检测IRS-1酪氨酸磷酸化水平.结果显示,与对照组相比,各实验组葡萄糖消耗量均显著增加(P＜0.01),且随着gAd浓度的增加,葡萄糖消耗量也逐渐增加;500 ng/ml gAd组及1 000 ng/ml gAd组IRS-1、PI3K、PKB的mRNA表达均比对照组显著增加(P＜0.05);同时,gAd可增加3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型IRS-1酪氨酸磷酸化水平,且呈浓度依赖性.提示gAd能够促进3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖的摄取,其机制可能与促进脂肪细胞胰岛素信号转导、改善胰岛素抵抗有关.     

葡萄糖和胰岛素对3T3-L1脂肪细胞内脏脂肪素mRNA表达的影响

目的研究不同浓度葡萄糖和胰岛素对3T3-L1脂肪细胞中内脏脂肪素（Visfatin）mRNA表达的影响。方法通过real—time RT-PCR方法检测不同浓度葡萄糖和胰岛素培养下3T3-L1脂肪细胞Visfatin mRNA的表达。结果葡萄糖增加了3T3-L1脂肪细胞Visfatin mRNA的表达;胰岛素降低其表达。结论葡萄糖和胰岛素对3T3-L1脂肪细胞中Visfatin mRNA的表达有凋控作用。     

不同胰岛素敏感状态下3T3-L1脂肪细胞中蛋白激酶B的表达

目的 建立不同胰岛素敏感状态的细胞模型,研究不同状态下蛋白激酶B(PKB)的表达. 方法 对3T3-L1脂肪细胞采用不同浓度葡萄糖(3.0 mmol/L、5.5 mmol/L和50.0 mmol/L)进行培养,应用胰岛素介导的3H-2脱氧-D葡萄糖摄取率,评价低糖组、对照组和高糖组3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性,并以RT-PCR方法检测葡萄糖刺激前后各组细胞中PKB的表达. 结果 3T3-L1脂肪细胞3H-2脱氧-D葡萄糖摄取率依次为,低糖组0.80±0.28,对照组0.53±0.33,高糖组0.32±0.13;在相同条件下.3组细胞间的PKB mRNA表达差异无统计学意义;但在葡萄糖刺激后普遍降低,低糖组、对照组和高糖组分别降低了52%、46%和59%,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 体外不同的葡萄糖浓度培养条件,可产生3T3-L1脂肪细胞不同的胰岛素敏感状态,而细胞在此条件下的PKB表达并无明显差异.     

脂联素球状结构域对3T3-L1脂肪细胞磷酸戊糖途径关键酶表达的影响

目的:通过探讨脂联素球状结构域(gAd)对3T3-L1脂肪细胞磷酸戊糖途径关键酶表达的影响,进而探讨gAd促进脂肪细胞摄取的葡萄糖是否经磷酸戊糖途径代谢。方法:用gAd干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,干预结束后测定细胞残液的葡萄糖浓度,并以实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各组细胞磷酸戊糖途径关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6PD)转录水平的表达情况,进行统计学分析。结果:各实验组细胞残液中葡萄糖浓度均显著低于对照组(均P     

二甲双胍通过AMPK/SIRT3通路促进脂肪酸培养的肌细胞自噬

目的探讨二甲双胍对高脂培养肌细胞自噬的作用及可能机制。方法用不同浓度棕榈酸(0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L)及二甲双胍(0.5、1、2、5、10 mmol/L)分别干预L6肌细胞24 h,CCK 8法检测肌细胞的存活率。棕榈酸和二甲双胍干预肌细胞24 h后,Western印迹检测微管相关轻链蛋白3(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白Beclin 1、泛素结合蛋白p62、沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)蛋白表达及腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平,RT-PCR技术检测上述基因的mRNA表达水平。结果棕榈酸剂量依赖性地降低肌细胞活力,2 mmol/L二甲双胍显示最佳的对抗作用。0.4 mmol/L棕榈酸和2 mmol/L二甲双胍干预肌细胞24 h后,棕榈酸显著减少LC3Ⅱ/LC3I、Beclin 1、SIRT3的蛋白及mRNA表达水平,降低AMPK磷酸化水平,显著增加p62的蛋白及mRNA表达水平(均P<0.05),棕榈酸的这些作用可被二甲双胍所对抗(均P<0.05)。结论二甲双胍可能通过刺激AMPK的磷酸化增加SIRT3的表达而增强脂肪酸培养的肌细胞自噬。     

二甲双胍通过激活AMPK降低同型半胱氨酸对内皮细胞的损伤

目的探讨二甲双胍能否降低同型半胱氨酸(Hcy)对血管内皮细胞的损伤及其可能的机制。方法培养人血管内皮细胞株(EC304人血管内皮细胞),分为对照组、Hcy组、二甲双胍组和Hcy+二甲双胍组,采用CCK-8检测细胞活力,采用乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒测定内皮细胞LDH、SOD活性及细胞内MDA含量,采用RT-PCR检测SOD1、过氧化氢酶(CAT)和NADPH氧化酶2(NOX2)mRNA的表达,采用Western blot检测AMPKα和p-AMPKα蛋白的表达。结果与对照组相比,Hcy组内皮细胞活力明显下降,LDH活性增加,细胞内MDA含量升高,SOD活性下降,SOD1和CAT mRNA表达水平显著下降,而NOX2 mRNA表达水平则明显升高,二甲双胍能够抑制Hcy引起的细胞活力下降及LDH、MDA增加;二甲双胍增加SOD活性,增加SOD1和CAT mRNA表达水平,减少NOX2 mRNA表达水平。AMPK抑制剂Compoud C则可以逆转二甲双胍对Hcy引起的内皮细胞损伤的保护作用。结论二甲双胍激活AMPK可能通过调控细胞内氧化应激抑制Hcy对内皮细胞的损伤。     

游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制

目的研究游离脂肪酸（FFA）对3T3-L1脂肪细胞IKKβ及胰岛素信号转导蛋白的影响,探讨FFA诱导胰岛素抵抗（IR）的分子机制。方法诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞与0.3-1.0mmol/L的软脂酸（PA）培养6-24h,以2-脱氧-〔^3H〕-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率,用Western blot检测IKKβ蛋白、IKKβ Ser181磷酸化、IRS-1蛋白、IRS-1 Ser307磷酸化、PI3Kp85蛋白及GluT4蛋白的表达。结果0.3-1.0mmol/LPA作用6-24h后,3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗明显减少,同时,Western blot显示,PA对IKKβ及GluT4蛋白的表达无明显影响,却能明显增加IKKβ Ser181及IRS-1 Ser307磷酸化,同时减少IRS-1蛋白和PI3Kp85蛋白的表达。结论FFA可以诱导IR,其分子机制可能与FFA激活IKKβ,使IRS-1丝氨酸残基磷酸化增加而酪氨酸残基磷酸化减少,进而使其下游的PI-3Kp85蛋白表达减少抑制葡萄糖转运有关。     

高糖诱导分化对3T3-L1成熟脂肪细胞线粒体形态和功能的影响

目的观察高糖诱导分化对3T3-L1成熟脂肪细胞葡萄糖转运以及线粒体功能的影响。方法 3T3-L1前体脂肪细胞分别在含25 mmol/L葡萄糖(高糖组)及5 mmol/L葡萄糖(低糖组)的DMEM培养基中诱导分化。采用油红"O"染色法观察细胞的分化程度,采用液闪仪检测成熟脂肪细胞对[3H]-2-脱氧葡萄糖的摄取率,采用透射电镜观察脂肪细胞的线粒体形态,生物发光法检测脂肪细胞内ATP。结果两组3T3-L1前体脂肪细胞均可分化为成熟脂肪细胞,高糖组成熟脂肪细胞体积及胞质内脂滴均较低糖组大;高糖组成熟脂肪细胞基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率均低于低糖组脂肪细胞;高糖组成熟脂肪细胞线粒体形态异常,细胞内ATP的含量为(63.00±2.48)nM/mg protein,低糖组为(102.00±1.39)nM/mg protein,两组比较,P<0.05。结论采用含25mmol/L或5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养,对3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化进程无明显影响;高糖诱导分化可致成熟脂肪细胞产生胰岛素抵抗和线粒体功能损伤。     

二甲双胍与肿瘤的关系

二甲双胍是常见的降糖药物,大量研究表明其可能有抗肿瘤作用,机制包括:(1)激活细胞内的AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路.(2)抗炎作用.慢性炎性反应与肿瘤的发生可能有关,二甲双胍能更有效减少炎性因子及C反应蛋白的水平.(3)提高T细胞的记忆,增强免疫系统对癌细胞和病毒感染的反应能力.(4)调控相关细胞凋亡因子.(...     

氧化型低密度脂蛋白诱导分子伴侣GRP78在3T3-L1脂肪细胞中的表达

目的观察氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导3T3-L1脂肪细胞内质网应激相关分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达,探讨ox-LDL对脂肪细胞内质网应激的诱导作用。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,分别给予不同浓度ox-LDL(50,100,200μg/ml)及内质网应激阳性对照诱导剂衣霉素(Tun)处理。用RT-PCR检测GRP78 mRNA的表达,筛选出最佳干预浓度,用最佳浓度的ox-LDL分别干预脂肪细胞6、12、24 h,分别用RT-PCR、Western印迹法检测GRP78 mRNA、蛋白表达情况。结果 ox-LDL呈浓度依赖方式诱导脂肪细胞GRP78表达,其表达强度随时间延长而增强,24 h达高峰(P<0.05)。结论 ox-LDL可诱导3T3-L1脂肪细胞发生内质网应激,促使未折叠蛋白反应信号通路的分子伴侣表达增加。     

二甲双胍对胰腺癌细胞转移相关基因S100A4和MMP-9 mRNA表达的影响

目的研究二甲双胍对人胰腺癌细胞系BxPC-3、AsPC-1的侵袭和转移相关基因S100A4和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9 mRNA表达的影响.方法体外培养胰腺癌BxPC-3、AsPC-1细胞,用不同浓度二甲双胍与细胞培养液孵育后,利用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活性,计算IC_(50)值后,应用IC_(50)浓度二甲双胍作用于胰腺癌细胞48 h,应用RT-PCR测定S100A4和MMP-9 mRNA表达的变化.结果二甲双胍对2种细胞生长呈时间和剂量依赖性抑制;二甲双胍处理后2种细胞在24、48、72 h的IC_(50)值:BxPC-3细胞分别为12.13、10.43、9.55 mmol/L;AsPC-1的细胞分别为23.45、15.44、11.30 mmol/L.IC_(50)浓度的二甲双胍作用48 h,BxPC-3、AsPC-1细胞S100A4和MMP-9 mRNA均较对照组明显下降(P0.01).结论二甲双胍可抑制胰腺癌细胞生长呈时间和剂量依赖性,二甲双胍可能通过抑制转移相关基因S100A4和MMP-9的表达来抑制胰腺癌的侵袭和转移.     

二甲双胍对人胰腺癌细胞迁移的抑制作用

目的:研究二甲双胍对胰腺癌细胞迁移的影响,并初步探讨可能机制.方法:体外培养人胰腺癌细胞株Bxpc-3,予二甲双胍进行干预作为实验组(M组),无药物组作为对照组(C组).MTT检测二甲双胍对Bxpc-3细胞存活率的影响,细胞划痕实验检测划痕愈合率,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,Elisa检测细胞培养上清液MMP-2、MMP-9蛋白的分泌量.结果:与对照组相比,MTT结果示二甲双胍可以抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖,并呈时间-浓度依赖性(F=8.991,124,114.61,P<0.01);划痕实验示二甲双胍干预组12、24、48h与对照组相比划痕愈合率显著下降(t=7.683,9.013,10.471,P<0.01);RT-PCR示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9mRNA的表达显著降低(t=16.563,28.494,P<0.01);Elisa示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9蛋白分泌明显下降(t=9.428,13.542,P<0.01).结论:二甲双胍能显著抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖及迁移,其主要机制可能与抑制MMP-2、MMP-9活性有关.     

外源性生长激素释放肽通过调节腺苷酸活化蛋白

目的 探索生长激素释放肽(Ghrelin)的心脏保护效应机制,明确外源性Ghrelin是否通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα2)及葡萄糖转运蛋白4(Glut4)表达而改善自发性糖尿病大鼠(GK)心脏功能.方法 GK大鼠编号随机分为3组:GK组、二甲双胍组(二甲双胍灌胃4周)和Ghrelin组(外源性Ghrelin腹腔注射4周),另选Wistar大鼠为对照.通过透射电镜观察大鼠心肌超微结构;应用多道生理记录仪观察大鼠心脏功能;留取大鼠动脉血液计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用RT-PCR法测量AMPKα2及Glut4基因表达.结果 实验4周后,与Wistar组及GK组比较,Ghrelin组心率降低,舒张、收缩功能改善(P＜0.05);Ghrelin组大鼠的HOMA-IR指数低于GK组(P＜0.05);Ghrelin组大鼠心肌内线粒体及心肌间微血管接近Wistar组;Ghrelin及二甲双胍干预后大鼠心肌AMPKα2和Glut4 mRNA表达量有明显增加(P＜0.05).结论 Ghrelin腹腔注射可减轻自发性糖尿病大鼠胰岛素抵抗,提高自发性糖尿病大鼠心脏左心室舒张和收缩功能,其机制可能与较长期在体上调心肌细胞AMPK表达而促进葡萄糖转运有关.     

二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的探讨不同浓度二甲双胍对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响及其对糖尿病肾病(DN)的保护机制。方法将大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常对照组(NC组)、高糖(HG组)及高糖+不同浓度二甲双胍组。48 h后,比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,RT-PCR方法测定细胞p22phox和p47phox mRNA表达情况。结果与NC组比较,HG组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显增加,上清液SOD活力明显降低,MDA含量明显增高(P0.05)。二甲双胍干预高糖组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显低于HG组(P0.05),且二甲双胍浓度越高,MCs p22phox和p47phox mRNA表达越低。结论二甲双胍可降低高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)氧化酶表达水平,从而起到减轻氧化应激的作用,该作用在二甲双胍治疗糖尿病时表现为对肾脏的保护作用。     

糖基化终产物对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性及SAA3基因表达的影响

目的探讨糖基化终产物（AGE）对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性及SAA3基因表达的影响。方法以2-DG摄入法观察葡萄糖的摄取率,用RT-PCR检测脂肪因子SAA3mRNA的表达。结果AGE显著减少3T3-L1脂肪细胞在胰岛素刺激下的葡萄糖摄取,呈剂量和时间依赖效应;AGE显著增加脂肪细胞SAA3mRNA的表达;呈剂量依赖方式。结论AGE能降低3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取,增加3T3-L1脂肪细胞对淀粉样蛋白的表达。