siRNA沉默P2X4表达对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效应

目的：探讨特异性P2X4 siRNA对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效果.方法：体外培养永生化小鼠小胶质细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组、转染siRNA-F1组.空白对照组未进行任何干预;阴性对照组转染Ncontrol siRNA;转染siRNA-F1组转染先前筛选出来的1条特异性siRNA.3组细胞分别用50μmol/LATP刺激,采用激光扫描共聚焦显微镜检测胞内钙离子浓度（[Ca2＋]i）;P2X4R/OX42免疫荧光双标染色观察细胞形态.结果：转染siRNA-F1组ATP活化小胶质细胞后,胞内钙离子释放较阴性对照组和空白对照组减少;P2X4R/OX42免疫荧光双标染色显示转染siRNA-F1组细胞存在活化态小胶质细胞和静息态小胶质细胞,而空白对照组和阴性对照组只存在活化态小胶质细胞.结论：siRNA-F1能部分抑制永生化小鼠小胶质细胞的活化.     

SiRNA干扰DLL4表达对A549细胞周期和凋亡的影响

目的 筛选DLL4基因的特异性小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),探讨DLL4对A549 细胞增殖、周期、凋亡的影响.方法 设计、合成并筛选针对DLL4的siRNA,转染A549细胞后,以RT-PCR和Western blot检测DLL4 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡变化,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 DLL4 siRNA能够明显下调A549细胞中DLL4 mRNA和蛋白的表达.并能抑制细胞的增殖(抑制率为43.85％);促进细胞凋亡(P＜0.05),G2/M期细胞比例明显增加(P＜0.05).结论 DLL4在肺癌细胞中也有表达,下调其表达后,能够抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡.     

siRNA对HepG2细胞mcl-1表达的影响

目的:探讨特异性siRNA对肝癌细胞系HepG2中mcl-1表达的影响.方法:将特异性siRNA经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2;半定量RT-PCR观察干扰前后mcl-1 mRNA水平变化,比较对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1的干扰效果,分析RNA干扰的特异性、时效性;Western Blot检测转染前后Mcl-1蛋白表达情况.结果:特异性siRNA片段能有效降低mcl-1 mRNA水平,最大干扰效率达67.25%,高于作为对照的非相关片段;对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1均可产生干扰作用,彼此间差别不大;干扰作用于转染后24 h即可出现,48 h达高峰,72 h稍有降低;Western Blot证明转染siRNA-F1后Mcl-1蛋白表达下调.结论:RNA干扰技术可有效下调肝癌细胞系HepG2中mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达.     

RNA干扰沉默VDR基因对小鼠成骨细胞Dmp1?Cbfa1及BMP-2 mRNA 表达的影响

目的:利用RNA干扰技术,阻断VDR在小鼠成骨细胞株mc3t3-E1中的表达,观察VDR表达受抑后对小鼠成骨细胞Dmp1、Cbfa1及BMP-2基因mRNA表达的影响.方法:针对小鼠VDR mRNA 144、594、852、3 628位点设计、合成4对21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4);在阳离子脂质体介导下转染mc3t3-E1细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,各组于转染24 h及72 h后收集细胞分别抽提RNA及蛋白.采用RT-PCR法检测细胞中VDR mRNA表达水平的改变,Western blot法检测VDR蛋白表达的变化,从而筛选有效序列.进一步应用SYBR Green荧光实时PCR方法定量检测成骨细胞功能基因-Dmp1、cbfa1及BMP-2基因mRNA表达情况.结果:与空白对照组相比,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞VDR mRNA和蛋白表达明显下调(P＜0.01).转染siRNA1、2及非特异性siRNA的mc3t3-E1细胞VDR的表达与对照组相比无显著差异(P＞0.05).荧光定量PCR结果显示,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞Dmp1、cbfa1、BMP-2mRNA表达明显下调(P＜0.01).结论:针对小鼠VDR mRNA 852、3 628位点设计、合成的siRNA可有效抑制小鼠成骨细胞株VDR的转录和表达;VDR表达受抑可下调mc3t3-E1细胞功能基因Dmp1、Cbfa1、BMP-2mRNA的表达;VDR在维持成骨细胞功能中起着一定的作用.     

RNA干扰靶向抑制酪氨酸蛋白激酶对哮喘小鼠树突状细胞功能的影响

目的 通过特异性微小干扰RNA(siRNA)靶向抑制小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的酪氨酸蛋白激酶(Syk)的基因表达,阻断树突状细胞的成熟,从而阻断Syk所介导的细胞内及细胞间的信号传导通路,研究Syk与DC之间的关系.方法 化学法合成21-23 bp的小鼠树突状细胞Syk基因siRNA片段A、B、C、D,用Lipofectamine 2000作为转染试剂,将siRNA片段转染哮喘小鼠骨髓来源DC,作用48 h后再与正常小鼠脾脏来源T淋巴细胞混合反应48 h,之后用ELISA法检测T淋巴细胞分泌细胞因子(IL-4、lL-13、IL-2和INF-γ)的水平.用Western Blot检测DC表达Syk蛋白的量,判断Syk基因是否被沉默,剔除无效片段.结果 siRNA片段A、C、D干扰组小鼠DC细胞Syk蛋白表达减少;B组没有明显变化,为无效片段.siRNA干扰组IL-4、IL-13的水平较未干扰组明显下降(P均<0.05),IL-2和INF-γ水平无显著差异(P>0.05).结论 Syk特异性SiRNA能够有效抑制Syk基因表达,可阻遏DC的抗原递呈作用以及活化、分化T淋巴细胞的功能.     

环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响

目的观察足细胞环氧合酶-2（COX-2）基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响。方法（1）以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象：分为正常对照组、5μl的siRNA组、10μl的siRNA组、15μl的siRNA组。经诱导分化成熟,在干扰48h后用半定量RT-PCR和Westernbolt分别检测COX-2mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平。（2）以10μl的siRNA组作为研究对象,分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组,用Westernboh检测nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平。结果（1）与正常对照组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15μ1的siRNA组凋亡率明显增高。（2）lμlCOX-2siRNA转染组nephrin蛋白表达显著低于阴性转染组（P〈0．05）。（3）与阴性转染组相比,10IxlCOX-2siRNA转染组Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-xl蛋白表达稍有下调。结论敲低COX-2的基因表达可以导致足细胞凋亡,并随着干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加;在干扰浓度为10μl时,足细胞nephrin蛋白的表达下调;BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡。     

小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究

目的 采用小片段RNA干扰(small interference RNA,siRNA)技术,通过构建系列小鼠4-1BB(m4-1BB)基因的特异性siRNA表达载体,体外观察对m4-1BB基因的瞬时沉默作用,筛选具有最佳干扰效果的siRNA表达载体.方法 设计并合成4条针对小鼠4-1BB全长特异性的siRNA寡核苷酸序列,插入真核表达载体(pENTRTM/U6 ),构建m4-1BB序列特异性siRNA 表达载体,根据靶位点分别命名为p336、394、498及763 siRNA,无关干扰质粒为pLacZ siRNA;通过体外m4-1BB真核表达质粒p4-1BB分别与各siRNA表达载体同时转染COS-7细胞,48h后通过RT-PCR和FACS(fluorescence-activated cell sorter,荧光活化细胞分选仪)观测COS-7细胞4-1BB mRNA及蛋白表达水平.结果经测序分析,各m4-1BB siRNA表达载体构建成功;其中p498 siRNA与p4-1BB双质粒转染COS-7 细胞,48h后可观察到细胞表面4-1BB分子明显下调,其胞内mRNA水平也显著降低,与无关干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).其余siRNA载体,几乎无干扰效应,与无关干扰组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论我们所构建的p498 siRNA 真核表达载体,能明显干扰m4-1BB蛋白的瞬时表达,可望用于m4-1BB Lentivirus干扰表达系统的构建,进一步在小鼠原代T淋巴细胞内实现高效4-1BB表达沉默,以深入研究4-1BB对T淋巴细胞的生物学影响.     

大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定

目的 应用特异性siRNA抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kit3.1基因表达;筛选出干扰效率最高的siRNA,并应用分子生物学方法进行鉴定.方法 设计并化学合成3条针对Kir3.1基因的siRNA,脂质体法转染原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞.应用Real-time PCR筛选出抑制效率最高的siRNA,将其转染入细胞;于转染后24 h、48 h、72 h提取细胞总RNA及蛋白质,分别采用Real-time PCR和Westem blot检测Kir3.1 mRNA及蛋白质表达情况.,结果 Real-time PCR显示siRNA-3干扰效率强于siRNA-1,2,能够显著下调心房肌细胞Kir3.1 mRNA的表达;siRNA-3转染心房肌细胞后,发现其在24,48,72 h均能使Kir3.1 mRNA及蛋白表达下降.结论 针对Kir3.1 mRNA合成的siRNA能够特异性干扰Kir3.1基因表达和蛋白质的合成,这可能为心律失常性疾病的治疗提供新的实验性依据.     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

高效小鼠CD40siRNA基因片段的筛选及对淋巴细胞CD40基因表达的影响

目的: 应用RNA干扰技术筛选高效小鼠CD40siRNA基因序列片段.方法: 体外化学合成小鼠CD40基因为靶标的siRNA 3对(siCD40-1、siCD40-2、siCD40-3),通过脂质体瞬时转染小鼠脾淋巴细胞(实验组),并分别以转染无关siRNA片段及未转染细胞作为对照(对照组).分别采用流式细胞术、实时荧光定量PCR检测转染24 h细胞表面CD40抗原、CD40 mRNA表达,蛋白质印迹检测转染48 h蛋白表达的变化.结果: 与对照组相比,实验组CD40抗原表达、CD40 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01);3对实验组siRNA能明显抑制CD40基因表达,抑制率分别为69%、78%和41%,差异有统计学意义(P< 0.05).而各对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论: siRNA可抑制小鼠淋巴细胞表达CD40,并具有良好的特异性,其中siRNA-2为最高效干扰片段.