GFAP基因克隆的免疫筛选对人脑胶质瘤cDNA基因文库质量的鉴定

用兔抗GFAP 抗体作为探针,自人脑胶质瘤cDNA 文库中,对GFAP 基因克隆进行了免疫初筛选。结果显示,在表达水平上GFAP 基因频率为0.02%。     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成cDNA文库的初步 …

东方田鼠（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｆｏｒｔｉｓ,ＭＤ）对日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐａｎｉｃｕｍ,Ｓｊ）感染具有抗性。为探讨Ｍｆ感染Ｓｊ后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答,作者用Ｍｆ受感染血清对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行免疫筛选,经初向下和复筛,共筛选出１２个阳性克隆,这些阳笥克隆经辅助噬菌体自动剪切后ＰＣ扩增显示,插入的Ｓｊ ｃＤＭＡ片较大小在３００ｂｐ～１．８ｋｂ之间,其中３００ｂ     

日本血吸虫cDNA库免疫筛选及部分克隆鉴定

本研究通过构建日本血吸虫成虫cDNA表达文库,用血吸虫病人混合血清从中筛选出日本血吸虫抗原基因表达克隆。以研制日本血吸虫病的分子诊断抗原和分子疫苗抗原。从日本血吸虫成虫提取总RNA并纯化mRNA,合成cDNA后,再与噬菌体λgt11重组构建cDNA文库(陈淑贞等1992)。     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库的初步报告

东方田鼠 (Microtusfortis,Mf)对日本血吸虫 ( Schistosomajaponicum ,Sj)感染具有抗性。为探讨Mf感染Sj后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答 ,作者用Mf受感染血清对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,经初筛和复筛 ,共筛选出 1 2个阳性克隆 ,这些阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切后PCR扩增显示 ,插入的SjcDNA片段大小在30 0bp～ 1 .8kb之间 ,其中 30 0bp片段 6个 ,1kb片段 1个 ,1 8kb片段 5个。说明Mf感染血清可识别Sj的特异性抗原分子。后者的免疫保护作用值得进一步研究     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

一种简单快速的cDNA文库构建方法

目的:建立一种以LDPCR(longdistancePCR)为基础的cDNA文库的快速构建方法。方法:以鲨鱼再生肝组织为材料获得总RNA,用偶联有Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含BamHⅠ酶切位点的Oligo(dT)16引物在逆转录酶MMLV的作用下合成cDNA第一链,进而利用末端转移酶在合成的cDNA第一链的3′末端引入polydC尾;以含BamHⅠ酶切位点的Oligo(dT)16和含HindⅢ酶切位点的Oligo(dG)10为引物,利用LDPCR合成双链cDNA,双链cDNA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,通过T4DNA连接酶连接到经相同双酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库,对文库的容量、重组率以及多样性进行分析。结果:通过本方法构建的cDNA文库容量约为5.84×105个/μgdscDNA,重组率为96.7%;对随机提取的30个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得25个不同的cDNA序列,且未见重复序列。结论:本法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析。     

一种鉴别尿潜血假阳性的方法

[目的]鉴别干化学分析法检测尿液尿潜血的假阳性.[方法]收集尿潜血+～+++号、UF-100尿沉渣分析仪检测尿红细胞< 25/μL、镜检尿红细胞阴性的尿液200份,取0.5 mL试管中,用免疫胶体金法检测,阳性者为真阳性,阴性者为假阳性.[结果]假阳性为84例,占42%;真阳性为116例,占58%.[结论]免疫胶体金法...     

利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库

目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础.方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株.以Poly ATtract System1000提取mRNA,用T7Select10-3 Orient Express cDNA CloningSystem和Random Primer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量.结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系.对QGY促增殖作用最强,以它作为建库细胞.对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息.结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有最高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库.     

缺血性脑水肿与水通道蛋白-4表达关系的研究

目的 探讨早期缺血性脑水肿后水通道蛋白-4（AQP-4）表达水平的动态变化及其与脑水肿形成的关系,进一步探讨脑水肿的发生机制。方法 取健康成年雄性SD大鼠62只,月龄3～4个月,体重250～300g,随机分为实验组（根据缺血时间分为1h,3h,6h,24h和72h五组）、对照组（包括假手术组和正常组）。参考Zea—Longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型,于术后应用干湿重法测定不同程度脑水肿状况下脑组织的含水量,应用Westernblot技术对AQP-4蛋白表达及其与脑水肿的关系进行相关性观察。结果脑缺血1h脑组织的含水量即开始增加（P〈0．05）,并随着时间的推移逐渐增加。AQP-4蛋白在缺血组织表达亦增强,缺血1h即开始增强,24h显著增加,72h仍然高于正常水平。结论 AQP-4是影响缺血性脑水肿的重要因素。     

A Study of the Technique of Western Blot for Diagnosis of Lyme Disease caused by Borrelia afzelii in China

Objective To study the technique of Western blot for the diagnosis of Lyme disease caused by Borrelia afzelii in China and to establish the standard criteria by operational procedure. Methods FP1, which is the representative strain of B. afzelii in China, was analyzed by SDS‐PAGE, electro transfer and immunoblotting assays. The molecular weights of the protein bands of FP1 were analyzed by Gel‐Pro analysis software. In a study using 451 serum samples (159 patients with Lyme disease and 292 controls), all observed bands were recorded. The accuracy of the WB as a diagnostic test was established by using the ROC curve and Youden index. Results Criteria for a positive diagnosis of Lyme disease were established as at least one band of P83/100, P58, P39, OspB, OspA, P30, P28, OspC, P17, and P14 in the IgG test and at least one band of P83/100, P58, P39, OspA, P30, P28, OspC, P17, and P41 in the IgM test. For IgG criteria, the sensitivity, specificity and Youden index were 69.8%, 98.3%, and 0.681, respectively; for IgM criteria, the sensitivity, specificity and Youden index were 47%, 94.2%, and 0.412, respectively. Conclusion Establishment of WB criteria for B. afzelii is important in validating the diagnostic assays for Lyme disease in China.     

孕期边缘型维生素A缺乏对NMDA诱导的新生大鼠神经元Ca~(2+)内流的抑制作用

目的 了解孕期边缘型维生素A(vitamin A,VitA)缺乏对氮-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate, NMDA)诱导的新生大鼠海马神经元Ca2+内流的影响.方法 将16只健康雌性Wistar大鼠采用随机数字表法分为边缘型VitA缺乏(MVAD)和VitA正常(VAN)组,每组8只.从交配前3周开始分别饲以VitA缺乏饲料(含VitA 400 IU/kg)和VitA充足饲料(含VitA 6 500 IU/kg).高效液相技术检测血清VitA浓度.取MVAD组及VAN组新生大鼠海马神经元进行原代培养,并运用钙影像测定仪检测原代培养的海马神经元在NMDA刺激后细胞内钙离子变化.Western blot半定量分析海马组织NMDA受体-1(NR1)的表达.结果 MVAD组母鼠血清VitA水平[(0.768±0.069)μmol/L]低于VAN组[(1.284±0.217)μmol/L],MVAD组仔鼠血清VitA水平[(0.806±0.092)μmol/L]低于VAN组[(1.270±0.098)μmol/L](P<0.01);神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolage,NSE)免疫荧光鉴定神经元纯度显示两组无显著差异(P>0.05);MVAD组与VAN组海马神经元在NMDA刺激后,MVAD组Ratio340/380增加值(0.136±0.012)低于VAN组(0.168± 0.022)(P<0.01);Western blot半定量分析结果显示NR1在MVAD组海马组织中的表达显著低于VAN组.结论 孕期开始的MVAD会抑制NMDA诱导的新生大鼠海马神经元钙离子内流,而降低NR1在神经元的表达可能是其损伤的机制之一.     

RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的ABCE1在人肺腺癌A549细胞增殖中的作用进行初步探讨。方法以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,针对其ABCE1基因序列设计小干扰RNA片段,重组其短发夹状RNA（shRNA）表达载体,转染入细胞。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法分别检测转染后ABCE1的mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测增殖能力。结果RT-PCR和Western blot显示shRNA对ABCE1基因和蛋白水平均有显著的下调作用。人肺腺癌A549细胞的生长速度减慢。结论下调ABCE1基因后,A549细胞的增殖能力得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗A549的靶点之一。     

免疫印迹法在实验大鼠汉坦病毒监测中的应用及与间接免疫荧光法之比较

用汉坦病毒汉滩株（７６－１１８）重组核蛋白作为免疫印迹法（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ以下简称ＷＢ）的诊断抗原，用于实验感染大鼠血清抗体效价测定。同时与用汉城株（ＳＲ－１１）感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作抗原的间接免疫荧光法（以下简称ＩＦＡ）进行比较。ＷＢ法对３／４标本在大鼠接种病毒后第３天测得血清ＩｇＭ阳性，而ＩＦＡ法仅１／４标本出现阳性，ＩＦＡ效价为１：５１２０的血清，ＷＢ效价为１’：４０９６０，且在血清１：１０稀释时反应带亦清晰。两种方法分别测定６４份大鼠血清。甩ＩＦＡ法，４４份（６８．８％）出现类似阳性的荧光颗粒，而用ＷＢ法测定，无特异的反应带出现。非感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作ＩＦＡ抗原，３０份（４６．９％）与正常细胞抗原有反应，此结果表明ＷＢ法在特异性和敏感性方面均高于ＩＦＡ法。ＩＦＡ法中的非特异性反应系血清与细胞成份之反应。     

GBLP在人脐静脉内皮细胞中差异表达的验证

目的 验证经手性药物比较蛋白质组学筛选鉴定的差异表达蛋白G蛋白β亚单位2样1蛋白(guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP).方法 分别用80 μmol/L的R/S-普萘洛尔(R/S- propranolol,R/S-PRO)处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)3 h.采用比较蛋白质组学方法分离鉴定差异表达蛋白-GBLP,Western blot法和激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)分别验证经R/S-PRO作用后,HUVEC细胞中GBLP的表达丰度差异和细胞内定位.结果 Western blot和LSCM都证实,GBLP在S-PRO作用后的HUVEC中的表达丰度明显低于经R-PRO作用后的表达(P=0.011);GBLP定位于HUVEC的细胞膜和细胞质中,在细胞质中呈均匀分布,在膜上有局部聚集分布现象.结论 Western blot和LSCM验证结果与蛋白质组学鉴定结果一致.     

胰腺癌组织中BRAF表达的初步研究

目的:了解BRAF基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平。方法:6例胰腺癌标本取自胰腺癌手术患者,3例正常胰腺组织取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。用Trizol法抽提每份组织的总RNA,分别进行紫外分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳及Lab on ch ip检测,对总RNA进行质控;应用实时定量PCR技术检测正常胰腺和胰腺癌组织BRAF的mRNA水平;应用W estern b lot检测BRAF的蛋白表达水平。结果:BRAF mRNA水平在正常胰腺组织中为0.001 016 7±0.000 25,胰腺癌组织中为0.002 606 2±0.001 09,上调2.56倍;W estern b lot显示,正常胰腺组织BRAF蛋白表达为6.70±2.50,胰腺癌组织为21.23±5.60,上调3.17倍。结论:胰腺癌组织中BRAF mRNA和蛋白表达水平均明显上调,其可能的调控机制及生物学效应还有待进一步研究。     

双向电泳法分析树舌多糖GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响

目的：探明树舌多糖（GAPS）GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响。方法：昆明种小鼠随机分为2组：肿瘤组和树舌多糖组,接种后各组肌肉注射给药,分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10天,于末次给药24h,处死小鼠,剥离肿瘤组织。应用2-DE技术检测各组小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白的表达。应用PDQuest软件分析电泳结果,找出差异表达的蛋白质点。根据近似等电点和分子量的数值进行数据库和文献综合检索,推测差异点的蛋白质身份。结果：肿瘤组共获得蛋白质点101个,树舌多糖组85个;其中54个蛋白点为肿瘤组特异表达,38个蛋白点为树舌多糖组特异表达;肿瘤组与树舌多糖组共表达的蛋白质点中,有14个点表达量相差两倍以上。第1098号斑点认为可能是抑癌基因PTEN的产物。结论：树舌多糖GF可以影响小鼠HepA瘤细胞多种可溶性蛋白的表达,这种影响很可能与树舌多糖GF的抗肿瘤机制有关;其抗肿瘤的作用靶点之一可能为抑癌基因PTEN。     

NMDA受体亚单位NR1在离体人神经干细胞中的表达

目的研究离体培养的人海马神经干细胞（NSCs）中NMDA受体亚单位NR1的表达。方法分离培养胎龄8-12周人胚脑海马神经干细胞,对NSCs进行Nestin和分化鉴定。用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹和RT—PCR等方法检测原代、传代1次、传代2次的人胚胎海马NSCs中NR1蛋白和mRNA的表达。结果在孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs中,NMDA受体亚单位NRI免疫细胞化学反应呈阳性,该受体亚单位的蛋白和mRNA均被检测钊。结论体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR1。     

INHBA基因多克隆抗体的制备与鉴定

目的INHBA的表达、纯化及多克隆抗体的制备;对纯化的抗原的初步鉴定。方法利用基因重组技术获得INHBA基因,将其构建到原核表达系统,并分离纯化得到分子量为64 kD的带有组氨酸标签的重组INHBA融合蛋白,用分离纯化后的INHBA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHBA的多克隆抗体。结果成功地获得INHBA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,Western blot检测结果显示,该抗体能特异性地与胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHBA表达系统,并对其做了初步的鉴定,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。