启动子DNA甲基化调节胃癌中PDX1基因表达

目的明确PDXl启动子DNA甲基化,探讨启动子甲基化对PDXl在胃癌中表达的调节作用。方法收集3例胃癌活检组织,免疫组化检测PDXl蛋白表达：吉西他滨处理3株胃癌细胞,RT—PCR检测不同药物剂量和作用时间下PDXlmRNA表达;构建PDXl报告基因,检测启动子活性及吉西他滨处理前后启动子活性的变化;甲基化特异性PCR（MSP）检测3株胃癌细胞和8对配对胃癌组织中PDXl启动子甲基化状态。结果免疫组化结果显示胃癌中PDXl表达低于正常胃黏膜;RT—PCR显示吉西他滨使PDXlmRNA重获表达,且随剂量和时间依赖性。F383有最强启动子活性,吉西他滨显著增加了PDXl启动子活性（P〈0．05）。F383在AGS、BCG823、SGC7901中呈DNA完全甲基化状态;87．5％的胃癌组织出现F383部分甲基化,12．5％出现完全甲基化。癌旁正常组织仅有37．5％出现F383部分甲基化,未出现完全甲基化,两者比较有显著性差异（P〈0．05）。结论PDXl启动子存在DNA高甲基化,抑制了胃癌中PDXl的表达。     

miR-181b靶向NDRG2对胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力的影响

目的研究miR-181b靶向NDRG2对胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力的影响。方法运用qPCR法检测miR-181b在胃癌及癌旁组织中的表达,运用Western blot法检测NDRG2在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达,用双荧光素酶报告基因系统检测miR-181b对NDRG2转录活性的影响,用Transwell实验检测过表达miR-181b对SGC-7901细胞侵袭迁移能力的影响,用Western blot法检测过表达miR-181b后SGC-7901细胞NDRG2的表达变化。结果与癌旁组织比较,胃癌组织miR-181b的表达明显升高,NDRG2蛋白表达水平明显降低(P0.01)。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-181b可以直接调控NDRG2的转录活性。过表达miR-181b后,SGC-7901细胞的侵袭和转移能力明显升高,NDRG2的表达水平下调(P0.01)。结论 miR-181b可靶向NDRG2的表达调控SGC-7901细胞的侵袭迁移能力。     

lncRNA XIST通过靶向miR-3666调控胃癌细胞增殖、侵袭转移机制北大核心CSCD

目的:探讨lncRNA XIST对胃癌细胞增殖、侵袭转移的影响及分子机制。方法:收集武汉市第四医院30例胃癌患者癌组织及癌旁组织,培养正常胃黏膜上皮细胞MRG-1、胃癌细胞SGC-7901和AGS,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA XIST和miR-3666表达水平;通过敲减胃腺癌细胞AGS中lncRNA XIST表达以及下调miR-3666表达水平,分析lncRNA XIST及miR-3666对胃癌细胞的调控作用,将细胞AGS分为si-NC组、si-XIST组、miR-NC组、miR-3666组、si-XIST+antimiR-NC组、si-XIST+anti-miR-3666组;MTT检测细胞增殖情况;Transwell检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测lncRNA XIST和miR-3666的靶向关系。结果:与癌旁组织和正常胃黏膜上皮细胞MRG-1比较,胃癌组织和AGS、SGC-7901细胞中XIST表达水平升高,miR-3666表达水平降低(P<0.05)。敲除lncRNA XIST或过表达miR-3666,AGS细胞增殖能力减弱,迁移和侵袭能力降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。lncRNA XIST靶向调控miR-3666,抑制miR-3666逆转了XIST基因敲除对胃癌AGS细胞增殖、运动性及凋亡的影响。结论:敲除lncRNA XIST可通过上调miR-3666抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。     

miR-125b通过靶向STAT3抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭迁移能力

目的研究miR-125b靶向STAT3对胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力的影响。方法运用qPCR法检测miR-125b在胃癌及癌旁组织中的表达,运用Western blot法检测STAT3在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达,用双荧光素酶报告基因系统检测miR-125b对STAT3转录活性的影响,用Transwell实验检测过表达miR-125b对SGC-7901细胞侵袭迁移能力的影响,用Western blot法检测过表达miR-125b后SGC-7901细胞STAT3的表达变化。结果与癌旁正常组织比较,胃癌组织miR-125b的表达水平明显降低,STAT3蛋白表达水平明显升(P0.01)。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-125b可以直接调控STAT3的转录活性。过表达miR-125b后,SGC-7901细胞的侵袭和转移能力明显降低,STAT3的表达水平下调(P0.01)。结论miR-125b可靶向STAT3的表达调控SGC-7901细胞的侵袭迁移能力。     

miR-26a下调COX-2的表达抑制胃癌AGS细胞增殖和侵袭

目的探讨miR-26a在胃癌组织和胃癌AGS细胞中表达量的改变及其对胃癌AGS细胞增殖和侵袭的影响。方法采用Real-time PCR法检测18例患者胃癌组织及对应的癌旁组织中miR-26a的表达。胃癌AGS细胞分别转染miR-NC和miR-26a,采用Western blot法检测转染前后细胞中COX-2的表达水平,同时采用CCK-8和克隆形成实验检测转染后AGS细胞的增殖和侵袭情况。结果 miR-26a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P0.01);COX-2在乳腺癌组织和细胞中的表达明显高于癌旁组织(P0.01)。转染miR-26a后,胃癌AGS细胞内COX-2的表达量显著下调。CCK-8和克隆形成实验结果显示,过表达miR-26a能明显抑制胃癌AGS细胞的增殖和侵袭(P0.01)。结论 miR-26a抑制胃癌AGS细胞的增殖和侵袭可能与下调COX-2的表达相关。     

胃癌中Cav-1的异常表达及其调控机制

目的：检测胃癌(gastric cancer, GC)细胞系及其组织标本中小凹蛋白-1(Cav-1)的表达,并探讨基因甲基化对Cav-1表达的影响。方法应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术检测胃癌细胞株(AGS、MKN45、BGC-823)及104例胃癌及相应癌旁组织中Cav-1基因的甲基化状态,应用RT-PCR技术检测胃癌细胞株中Cav-1 mRNA的表达,应用免疫组化法检测胃癌组织中Cav-1的表达。结果甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-Dc)处理细胞株后,AGS中Cav-1 mRNA由阴性表达恢复为阳性表达,MKN45及BGC-823中Cav-1 mRNA在处理前后均呈阳性;用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A( trichostatin A,TSA)分别处理3株细胞,处理前后Cav-1 mRNA表达均无明显变化。 MSP检测结果显示,AGS细胞株可扩增出甲基化条带,5-Aza-Dc处理后,甲基化条带消失,MKKN45及BGC-823处理前后均无甲基化条带扩出。胃癌组织中Cav-1基因甲基化率为29．8%(31/104),明显高于癌旁组织(P=0．000);癌组织中Cav-1基因高甲基化与患者淋巴结转移及上消化道肿瘤家族史(upper gastrointestinal cancers, UGIC)相关(P<0．05),与病理分级及临床分期无关(P>0．05);胃癌组织中Cav-1的阳性率为51．9%(54/104),明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P=0．000),且癌组织中Cav-1表达与其基因高甲基化状态明显相关(P=0．000)。结论 Cav-1在胃癌组织中表达下调,并且基因启动子区CpG岛的高甲基化状态可能是引起其表达下调的机制之一。     

MiR-141对胃癌细胞SGC-7901增殖、侵袭能力的影响

目的观察miR-141在胃癌组织中的表达变化,及miR-141对胃癌细胞株SGC-7901增殖、侵袭能力的影响。方法收集116例胃癌患者的胃癌组织及癌旁正常胃组织,采用real-time PCR方法检测miR-141的表达水平,将化学合成的miR-141拟物和miR-141抑制剂转染至胃癌SGC-7901细胞,分别于培养12、24、48、72 h后采用MTT法检测细胞增殖能力,培养24 h后Transwell小室检测细胞侵袭能力,采用Western blot法检测细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白的表达。结果胃癌组织中miR-141相对表达量显著低于癌旁组织(P0.01)。转染miR-141模拟物24、48、72 h后,SGC-7901细胞增殖能力显著降低,转染miR-141抑制剂后SGC-7901细胞增殖能力显著升高(P0.01)。转染miR-141模拟物24 h后,穿膜细胞数、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白相对表达量显著降低,转染miR-141抑制剂后穿膜细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量显著升高(P0.01)。结论胃癌组织中miR-141低表达可能与胃癌的发生发展有关,miR-141抑制胃癌细胞增殖、侵袭的作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。     

MicroRNA-10b对人胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Micro RNA-10b(miR-10b)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法应用Real-time PCR方法检测21例胃癌组织和癌旁正常组织中miR-10b的表达水平,应用Lipofectamine?LTX试剂将化学合成的miR-10b mimics和miR-10b inhibitor转染至胃癌SGC-7901细胞,采用MTT方法检测SGC-7901细胞增殖能力的变化,Transwell小室法检测SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的变化;应用Western Blot方法检测P21蛋白表达水平。结果与正常组织相比,miR-10b在胃癌组织中的表达水平显著增高。与对照组相比,miR-10b表达沉默能够显著抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力,显著增加P21的蛋白表达水平。miR-10b过表达的作用与之相反。结论 MiR-10b沉默抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭可能与上调P21蛋白表达相关。     

GRP78在胃癌生长中的作用*

 目的： 探讨内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78）参与胃癌细胞生长的作用。方法: 回顾性分析34例胃癌及34例癌旁组织,利用组织微阵列技术,构建组织阵列,采用免疫组织化学技术SP法检测该阵列中GRP78蛋白在胃癌及其癌旁组织中表达情况。利用Western blotting检测人体胃癌组织、癌旁组织（肿瘤旁1 cm处）和正常组织（远离肿瘤≥10 cm处）中GRP78蛋白的表达情况。利用Western blotting检测人胃癌细胞SGC7901和过表达GRP78的SGC7901-H78细胞（稳定转染GRP78）中GRP78和生长相关蛋白cyclin D1的表达情况。结果: (1) 免疫组织化学检测发现：人体胃癌组织中GRP78表达水平明显高于癌旁组织和正常组织,且与性别、分化程度相关（P<0.05）; (2) Western blotting检测发现：胃癌组织中GRP78蛋白的表达明显高于癌旁组织和正常组织;(3)  Western blotting检测发现： 相对于SGC7901细胞,SGC7901-H78细胞中GRP78蛋白的表达明显升高,同时检测生长相关蛋白cyclin D1的表达发现,随着GRP78表达的上调,cyclin D1蛋白表达增加。结论: GRP78蛋白的高表达可能参与了胃癌细胞的生长。     

DNMT2在胃癌的表达及靶向抑制

目的 研究DNA甲基化转移酶2(DNMT2)在胃癌的表达,并分析靶向抑制DNMT2对胃癌的影响.方法 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行DNMT2表达研究.构建3个靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-1,DNMT2-siRNA-2,DNMT2-siRNA-3).转染DNMT2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR 及Western免疫印迹法验证DNMT2的抑制效果.噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率.结果 胃癌组织DNMT2表达率43.3％,显著低于癌旁组织的93.3％(P＜0.05);晚期及低分化胃癌组织的DNMT2表达率更低(P＜0.05).DNMT2在胃癌细胞核表达显著.DNMT2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-3).发现转染DNMT2-siRNA-3后96 h与120 h,SGC-7901增值率1.138±0.110与1.078±0.060较对照增殖率1增加(P＜0.05).结论 DNMT2在胃癌表达降低,抑制DNMT2可能利于胃癌增殖.     

Methylation-silencing RCC1 expression is associated with tumorigenesis and depth of invasion in gastric cancer

Introduction: Regulator of chromosome condensation 1 (RCC1) is a critical cell cycle regulator. We firstly identified RCC1 gene hypermethylation in gastric tumor tissues using the differential methylation hybridization (DMH) microarray, but the role of RCC1 in the pathogenesis of gastric carcinoma is largely unknown. Methods: Three gastric cancer cell lines (AGS, MKN45, and TSGH9201) were used to analyze RCC1 gene methylation, mRNA and protein expressions. Furthermore, 85 pairs of matched human gastric carcinoma samples in a tissue microarray were used to analyze RCC1 expression by immunohistochemistry staining. Results: A differential methylation pattern was found in TSGH9201 (100%), MKN45 (87%), and AGS (62%) cell lines at the 9th CpG site of RCC1 exon 1. RCC1 mRNA and protein expressions in AGS cells were significantly higher than in TSGH9201 and MKN45 cell lines (P < 0.05). Tissue array data showed that RCC1 expression was detected in 21% (18/85) of gastric carcinoma tissues and in 80% (76/95) of adjacent non-tumor tissues. The expression of RCC1 in gastric carcinoma tissues was significantly lower than in adjacent non-tumor tissues (P < 0.001). Furthermore, an association between RCC1 expression and clinicopathological features showed that RCC1 expression was closely correlated with tumor differentiation and depth of invasion (P < 0.05). Conclusions: Our data indicate that RCC1 expression is frequently lost in poorly differentiated gastric cell lines and gastric carcinoma tissues. Loss of RCC1 expression is correlated with tumor differentiation and depth of invasion. These findings suggest that RCC1 may play a tumor suppressor role in gastric carcinoma.     

Lactobacillus acidophilus 74-2 and butyrate induce cyclooxygenase (COX)-1 expression in gastric cancer cells

Cyclo-oxygenase (COX) profile predicts prognosis of gastric cancer; COX-2 positive tumors are more often aggressive, and COX-2 suppression is protective against gastric cancer. In contrast, COX-1 suppression is harmful to the intestinal mucosa. The COX-1, COX-2, and COX-1ir expression profiles were measured with real-time PCR in primary (AGS) and metastatic (NCI-N87) gastric adenocarcinoma cell lines treated with butyrate, hyperosmolar medium, and, in the case of NCI-N87, cell-free supernatants of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus 74-2 and Bifidobacterium lactis 420. The cell lines showed differences in the profile when treated with either hyperosmolar medium or butyrate. In NCI-N87 COX-2 expression was higher but only COX-1 expression was significantly upregulated by butyrate. Similarly to butyrate, the cell-free supernatant of L. acidophilus 74-2 upregulated COX-1, while COX-2 expression remained unchanged. COX-1ir, including COX-3, was upregulated by probiotics and osmotic stress. In conclusion, consumption of L. acidophilus 74-2 could be beneficial for the expression of cytoprotective COX-1.     

食管鳞状细胞癌中SFRP基因家族启动子区甲基化状态的检测

目的: 检测食管鳞状细胞癌(ESCC)中Wnt通路拮抗基因家族分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)基因的甲基化状态,探讨其与食管鳞癌发生的关系。方法: 应用甲基化特异性PCR(MS-PCR)及RT-PCR的方法检测78例食管鳞癌及相应癌旁非肿瘤组织中 SFRP1 、 SFRP2 、 SFRP4 和 SFRP5 基因的甲基化状态及mRNA表达情况,并分析其与Wnt通路中心因子β-catenin蛋白表达的关系。结果: 在食管鳞癌组织中, SFRP1 、 SFRP2 、 SFRP4 和 SFRP5 基因的甲基化率分别为65.4%(51/78)、69.2%(54/78)、62.8%(49/78)和52.6%(41/78),均明显高于癌旁非肿瘤组织(P<0.01)。这4个基因的甲基化率与肿瘤患者的组织学分级及临床分期均无关,但它们共同发生甲基化的频率则与临床分期显著相关(P<0.05)。这4个基因mRNA的阳性表达率分别为42.3%(33/78)、46.2%(36/78)、50.0%(39/78)和39.7%(31/78),均明显低于癌旁非肿瘤组织(P<0.01)。在发生甲基化的食管癌组织中这4个基因的mRNA表达阳性率及β-catenin蛋白的异质表达率均明显低于未发生甲基化的癌组织,且差异显著(P<0.05)。结论: 食管鳞癌组织中 SFRP1 、 SFRP2 、 SFRP4 和 SFRP5 基因均呈高甲基化状态,并有可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路参与了食管癌的发生。联合检测SFRP基因家族甲基化状态对于食管癌的预后判断有一定指导意义。     

Lactobacillus acidophilus 74-2 and Butyrate Induce Cyclooxygenase (COX)-1 Expression in Gastric Cancer Cells

Cyclo-oxygenase (COX) profile predicts prognosis of gastric cancer; COX-2 positive tumors are more often aggressive, and COX-2 suppression is protective against gastric cancer. In contrast, COX-1 suppression is harmful to the intestinal mucosa. The COX-1, COX-2, and COX-1ir expression profiles were measured with real-time PCR in primary (AGS) and metastatic (NCI-N87) gastric adenocarcinoma cell lines treated with butyrate, hyperosmolar medium, and, in the case of NCI-N87, cell-free supernatants of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus 74-2 and Bifidobacterium lactis 420. The cell lines showed differences in the profile when treated with either hyperosmolar medium or butyrate. In NCI-N87 COX-2 expression was higher but only COX-1 expression was significantly upregulated by butyrate. Similarly to butyrate, the cell-free supernatant of L. acidophilus 74-2 upregulated COX-1, while COX-2 expression remained unchanged. COX-1ir, including COX-3, was upregulated by probiotics and osmotic stress. In conclusion, consumption of L. acidophilus 74-2 could be beneficial for the expression of cytoprotective COX-1.     

胃癌组织CDKN2A基因座p14ARF基因变异及意义

目的:探讨胃癌组织p14^ARF基因变异及其意义。方法: 应用PCR、PCR-SSCP、PCR甲基化分析法和RT-PCR分别检测48例胃癌及癌旁组织中p14^ARF基因纯合性缺失、突变、CpG岛甲基化及其mRNA表达状况。结果:①胃癌组织p14^ARF基因纯合性缺失率为31.3%(15/48), 癌旁组织均未见纯合性缺失。②33例无纯合性缺失的胃癌及癌旁组织均未见p14^ARF基因点突变。③胃癌组织p14^ARF基因甲基化率为47.9%(23/48), 癌旁组织仅2例甲基化, 两者差异有显著(P＜0.01)。④45.8%(22/48)的胃癌组织p14^ARFmRNA无表达。3例外显子E1β和E2共甲基化者p14^ARFmRNA均无表达(100%), 20例单纯E2甲基化者仅3例无表达(15%), 两者差异有显著(P＜0.05)。ARF基因失活多由纯合性缺失和5’CpG岛甲基化所致, 其表达缺失与胃癌的发生密切相关。     

Dact1基因在结直肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的：观测Dact1基因在结直肠癌组织的表达及其启动子甲基化状态,并探讨它们之间的关系及在结直肠癌发生中的作用.方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结直肠癌组织、癌旁组织各50例及正常对照组织20例Dact1基因mRNA的表达情况,甲基化特异性PCR（MSP）检测Dact1基因启动子甲基化状态.结果：结直肠癌组中,9例Dact1基因mRNA失表达（18%）,20例表达低于正常对照组（40%）;癌旁组织组中,1例Dact1基因mRNA失表达（2%）,3例表达低于正常对照组（6%）;正常对照组中,1例Dact1基因mRNA低表达（5%）.Dact1基因在癌组织、癌旁组织、正常对照组织中的甲基化阳性率分别为46%、12%、5%,癌组织组与癌旁组织组及正常对照组阳性率比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）,而癌旁组织组和正常对照组阳性率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.Dact1基因mRNA的失表达（低表达）与其启动子甲基化状态的相关性分析有统计学意义（P＜0.05）.结论：Dact1基因mRNA的失表达（低表达）可能参与了结直肠癌的发生发展,其失表达可能与Dact1启动子区甲基化相关.     

急性白血病细胞系中SFRP基因启动子甲基化及去甲基化诱导表达的研究

 目的：探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）基因家族启动子CpG岛异常甲基化状态与急性白血病（AL）发生发展的关系,以及DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷酸（5-Aza-CdR）去甲基化诱导SFRP基因表达作用的可能机制。方法：采用甲基化特异性PCR检测不同AL细胞系（Molt-4、Jurkat、HL-60和NB4）和不同浓度5-Aza-CdR作用下Jurkat细胞系中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因启动子区的甲基化状态,采用实时荧光定量RT-PCR检测SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表达,采用半定量RT-PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达。结果：在正常人细胞中不存在SFRP基因的甲基化。SFRP1、SFRP2和SFRP5基因在HL-60、NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中均呈完全甲基化状态;SFRP4基因在NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中完全甲基化,在HL-60细胞系中则部分甲基化。5-Aza-CdR可逆转SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的高甲基化状态,并能够下调DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平,诱导SFRP基因恢复表达。结论：在AL细胞系中,SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因出现高甲基化,与AL的发生密切相关,可能成为AL新的基因标志物。5-Aza-CdR通过抑制DNMT表达,逆转SFRP基因的甲基化状态,恢复其表达。     

原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常

为检测胃癌组织中抑癌基因p16,p15及其启动子区甲基化状态和P16、P15蛋白表达情况。选择p16、p15基因及启动子区域，用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）和测序法对100例胃癌患者的癌组织、癌旁正常组织和5例正常组织进行检测，同时用免疫组化法检测了癌组织和正常对照组织的P16和P15的表达。结果发现癌组织p16和p15基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织和正常对照；胃癌组织中，71％的病例P16表达阴性，54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化，无突变和纯合缺失检出；11％的病例P15表达阴性，9％的病例具有p15基因启动子区的高甲基化，p15异常与低分化胃癌有关，p15基因内含子1和外显子1内各发现1例DNA序列改变；癌组织中p16和p15基因启动子区甲基化与其蛋白表达密切相关。结果显示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的关键因素之一，并在胃癌的发生发展中发挥重要作用；p15基因启动子区域高甲基化在胃癌中起一定作用。