细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

粪肠球菌介导的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗的构建、鉴定及表达北大核心CSCD

目的构建粪肠球菌(Efs)为载体的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗,并研究其表达效率。方法采用电穿孔技术将重组质粒pGEX-Eg95-EgA31转化粪肠球菌ATCC47077株,构建rEfs-Eg95-EgA31疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定;经IPTG诱导后进行10%SDS-PAGE和Western blot等分析和鉴定表达产物。结果以从rEfs抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出约1016 bp的Eg95-EgA31融合基因片段,SDS-PAGE显示表达产物为62.5 ku的重组蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的11%;Western blot表明重组蛋白能被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫rEfs-Eg95-EgA31疫苗,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒构建及鉴定

目的 构建并鉴定细粒棘球绦虫(Eg)转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒.方法 从细粒棘球蚴包囊中分离原头节.经超声粉碎后抽提总RNA,反转录成eDNA,设计合成引物,以eDNA为模板.通过PCR从cDNA中扩增出目的 基因Eg95,经电泳及测序鉴定后,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒,电穿孔转化根癌农杆菌(At)LBA4404株;从转化的At阳性株中抽提质粒进行双酶切和以抽提的质粒为模板进行PCR鉴定.结果 RT-PCR扩增出1条约471 bp的特异性条带,DNA序列分析与GenBank知的序列同源性为100%.从转化的At中抽提的质粒,双酶切及PCR测定的结果与预期相符.结论 成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率、抗体及其亚类的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;收集血清,常规ELISA测定血清IgG及其亚类和IgE水平,试验设有空载体、Bb和MRS对照。结果皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔内接种组和口服灌胃组免疫小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%,血清IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1水平显著升高,IgG3和IgE水平显著降低。结论接种Bb-Eg95-EgA31疫苗能诱导小鼠产生保护力,IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1起重要作用。     

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。 方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板, PCR扩增获117 bp 的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和 471 bp 的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261, 经酶切、 PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗, 卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。 结果质粒pSMEg95经双酶切、 PCR扩增及测序鉴定, 证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261, 并将此重组质粒导入BCG菌, 经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗 (rsBCG-Eg95)构建成功。 结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。     

细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建

目的分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗。方法分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列。先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95。再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95。电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌。结果双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因Eg95序列和Ag85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功。结论构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗。     

细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究

目的分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率。方法用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质。结果表达产物分子质量单位约为37.5ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%。结论细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞亚群的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比,同时设有空载体、Bb和MRS对照。结果以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,鼻腔内接种和口服免疫组的的CD4+T细胞亚群和CD4+/CD8+比值显著高于皮下和肌肉注射组。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用。疫苗鼻腔内接种和口服免疫是两种较好的免疫途径。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

细粒棘球绦虫EgA31重组蛋白的抗原表位分析预测

根据GenBank中细粒棘球绦虫EgA31序列(GenBank登录号为AF067807)设计引物,以细粒棘球绦虫mRNA为模板,RT-PCR扩增EgA31基因,将其克隆入pUCm-T载体,转化大肠埃希菌(E coli)DH5α,筛选阳性克隆,经BamH I、Sac I双酶切和PCR鉴定,获得阳性重组质粒pUCm-T/EgA31,并将测序正确的片段连接表达载体,成功构建重组质粒pET30a-EgA31。经序列分析和同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞和T细胞表位分析,结果表明PCR扩增的特异条带为636 bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为100%。编码产物B细胞和T细胞联合表位预测,氨基酸区域可能在32～79、79～95、105～124和141～154位。