TRAIL联合阿霉素诱导肝癌耐药株凋亡的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)及TRAIL和阿霉素(ADM)联用对肝癌耐药株诱导凋亡的作用。方法通过浓度递增法用阿霉素处理人肝癌细胞株HepG2获得肝癌耐药株HepG2/ADM。并通过MTT方法鉴定耐药株的耐药性。构建可溶型TRAIL真核表达质粒真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL。通过脂质体(Lipofectamine)2000介导转染质粒入HepG2/ADM。通过RT-PCR和Westernblot证实转染的HepG2/ADM有sTRAIL的mRNA和蛋白的表达后,用MTT方法和AnnexinVFITCPI染色流式细胞仪检测单纯TRAIL处理和联合阿霉素处理HepG2/ADM的生长抑制率和凋亡率。并用共聚焦显微镜观察处理后细胞凋亡的形态。结果肝癌耐药株筛选成功,sTRAIL质粒构建、转染成功。用MTT测HepG2/ADM抑制率阿霉素处理组40.9%;TRAIL处理组29%;合用组58.4%;联合后抑制率有显著差异。凋亡检测为阿霉素处理组18.37%;TRAIL处理组14.8%;合用组52.71%。但TRAIL处理HepG28.9%和HepG2/ADM8.54%的凋亡率无显著差异。结论TRAIL联合阿霉素能明显增加HepG2/ADM的凋亡从而逆转耐药。同时单纯TRAIL治疗对耐药株作用与亲代细胞作用相仿,说明TRAIL可能有另外的诱发凋亡的途径,受HepG2/ADM耐药性的影响小。     

低剂量阿霉素联合TRAIL诱导人前列腺癌细胞LNCAP凋亡的实验研究

目的 研究低剂量阿霉素联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人前列腺癌细胞LNCAP凋亡的作用和机制,为提高肿瘤治疗效果提供理论依据.方法 采用蛋白印迹、流式细胞术、MTT等实验技术,检测TRAIL和低剂量阿霉素分别或者联合处理LNCAP细胞后细胞的生存率变化、相关受体及其配体系统、凋亡相关蛋白(c-FLIP,BCL-2,XIAP)的变化.结果 低剂量阿霉素(0.86 μmol/L)可以增加细胞表面DR4和DR5的表达,同时减少凋亡抑制蛋白c-FLIP的表达,增强TRAIL诱导LNCAP细胞凋亡的敏感性.结论 低剂量阿霉素(0.86 μmol/L)可以增强TRAIL对LNCAP细胞的凋亡诱导效应.     

TRAIL联合环氧合酶抑制剂体外诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨塞莱昔布增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2、Hep3B凋亡的分子机制.方法 应用流式细胞仪分析塞莱昔布联合应用TRAIL对肝癌细胞HepG2和Hep3B细胞周期的影响;Western blot检测HepG2和Hep3B细胞在塞莱昔布作用前后凋亡信号传导蛋白caspase-8,caspase-3,caspase-9,DR4,DR5,DcR1,c-FLIP,RIP,Cytc,Smac和Bid的表达变化.结果 联合用药组中HepG2及Hep3B细胞生存率分别为29.37%±2.68%和22.75%±2.77%,显著低于塞莱昔布单独用药组的73.04%±4.03%和66.90%±3.47%(t=9.975,P＜0.01).塞莱昔布预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加Cytc、Smac、Bid的表达,但对DR4、DR5、DcR1的表达无明显影响.结论 TRAIL联合塞莱昔布通过下调c-FLIP及RIP的表达,活化死亡受体通路及上调Bid的表达,激活线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡.     

TRAIL联合IFN-γ诱导骨肉瘤细胞凋亡实验研究

目的 观察干扰素(IFN)-γ协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的作用,初步探讨协同作用机制,并观察联合用药时对成纤维细胞的毒性作用.方法 应用相差显微镜和电镜观察MG-63细胞经TRAIL、IFN-γ及TRAIL联合IFN-γ作用后细胞形态学变化;进行四唑盐比色试验观察不同实验组MG-63细胞和成纤维细胞抑制率;流式细胞仪观察细胞凋亡情况;逆转录-聚合酶链反应法观察IFN-γ作用后TRAIL膜受体表达情况.结果 TRAIL联合IFN-γ应用时,随着IFN-γ作用时间的延长,细胞悬浮、空泡化等现象逐渐明显,且在作用24小时最为显著,电镜显示细胞凋亡的特征性变化;联合用药组细胞抑制率较单独TRAIL组增加,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组细胞凋亡率显著增加(P<0.01);应用IFN-γ前后,TRAIL死亡受体(DR)4的相对表达量增加,IFN-γ作用24小时表达量最大,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组对成纤维细胞的毒性,与单独TRAIL组相比没有显著增加(P>0.05).结论 IFN-γ可协同TRAIL诱导MG-63细胞凋亡,DR4表达量增加可能是协同作用的缘故,联合用药不会增加对成纤维细胞的毒副反应.     

阿霉素协同TRAIL真核表达载体诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的探讨阿霉素与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）真核表达载体诱导前列腺癌细胞凋亡的协同作用.方法 RT-PCR方法克隆人TRAIL全长基因,并插入真核表达载体pLXIN多克隆位点,经酶切和测序鉴定.将pLXIN-TRAIL质粒转染PC3-M细胞,RT-PCR方法检测外源性TRAIL表达率,TUNEL染色和流式细胞术比较单独表达TRAIL和联合应用阿霉素对PC3-M细胞凋亡率的影响,Western blot法检测经阿霉素诱导前后PC-3M细胞死亡受体-5（DR5）的表达变化.结果成功构建pLXIN-TRAIL真核表达载体,外源性TRAIL表达可以诱导PC-3M细胞凋亡,阿霉素能够增强TRAIL的凋亡诱导效应,6μg pLXIN-TRAIL质粒DNA组,加入1 mg/L阿霉素前后平均凋亡率分别为11.8%和20.7%,同时可提高PC-3M细胞DR5的表达. 结论 TRAIL真核表达载体介导的细胞凋亡是治疗前列腺癌的新途径,阿霉素可以通过提高DR5表达而增强PC-3M细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感性.     

TRAIL联合HSP90抑制剂17-AAG诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的 探讨17-AAG增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制.方法 应用流式细胞仪分析17-AAG联用TRAIL对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响;Western blot检测HepG2细胞在17-AAG作用前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、caspa8e-3、c-FLIP、RIP及NF-KB上游调节激酶Akt、IKb-α蛋白的表达变化.结果 联合用药组的细胞生存率为(17.25±2.34)%,显著低于17-AAG单独用药组的[(93.14±5.25)%,P<0.01];17-AAG预处理,随其浓度和时间的增加能明显下调RIP的表达,进而影响Akt的磷酸化,但对c-FLIP的表达无明显影响.结论 TRAIL联合17-AAG可以诱导肝癌细胞凋亡,其机制是通过下调RIP的表达,活化凋亡发生的死亡受体通路及阻断NF-κB通路来实现的.     

TRAIL联合喜树碱体外诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨喜树碱增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2和Hep3B凋亡能力的分子机制。方法应用流式细胞仪分析TRAIL单独或联合应用喜树碱对肝癌细胞系HepG2和Hep3B细胞凋亡的影响；Western blot检测HepG2和Hep3B细胞在处理前后凋亡信号传导蛋白caspase-8，caspase-3，caspase-9，DR4，DR5，DcRl，c—FLIP，RIP，cytc，Smac和Bid表达的变化。结果喜树碱能增强TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的能力，两者联用具有明显的协同作用。喜树碱预先处理能下调c—FLIP及RIP的表达及增加cytc，Smac，Bid的表达，但对DR4，DR5，DcRl的表达无明显影响。结论TRAIL联合喜树碱可以诱导肝癌细胞凋亡；其机制是下调c—FLIP及RIP的表达，活化凋亡发生的死亡受体通路，上调Bid的表达激活线粒体通路。死亡受体的表达不参与这一变化过程。     

表阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的 研究表阿霉素对肝癌细胞凋亡的影响.方法 在体外培养的肝癌细胞中加入不同浓度的表阿霉素,应用光镜、电镜、DNA凝胶电泳及流式细胞术检测肝癌细胞凋亡的形态学特征、生化学特征.细胞凋亡百分率及细胞周期的变化.结果 在表阿霉素作用下,凋亡的肝癌细胞出现膜小泡、凋亡小体等特征性改变;DNA电泳呈现典型的“梯状”条带;流式细胞术测定,出现典型的凋亡峰,其凋亡百分率随着药物浓度的提高和作用时间的延长而明显升高;同时,G_(1/0)期和S期细胞含量下降,而G_2/M期细胞含量上升.非凋亡细胞则无此表现.结论 表阿霉素可诱导肝癌细胞发生凋亡,并可使肝癌细胞生长受阻于G_2/M期,这可能是其杀伤肿瘤的一种重要机制.     

阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡机制的研究

探讨阿霉素诱导HCC-9204细胞凋亡的作用机制,及其与凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的关系。方法用TUNEL法和流式细胞仪观察和检测阿霉素对HCC-9204细胞增殖周期的影响以及细胞凋亡,并检测HCC-9204细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果阿霉素能够显著诱导HCC-9204细胞凋亡,染色显示有典型的凋亡特征。在药物处理24h后流式细胞仪检测出显著的“亚二倍体峰”。阿霉素作用HCC-9204细胞后,Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.05);而Bax蛋白的表达虽有所增加,但与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论阿霉素能诱导癌细胞凋亡,是其发挥抗癌作用的重要机制之一,这可能与其下调Bcl-2基因表达有关。     

TRAIL基因与顺铂协同诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因(TRAIL)和顺铂联合应用对人RD胚胎型横纹肌肉瘤细胞的生长抑制和凋亡的诱导作用。方法 将重组腺病毒载体(Ad)介导的TRAIL基因作用于人RD胚胎型横纹肌肉瘤细胞，通过电镜、MTT比色法、RT-PCR及流式细胞仪方法，观察和分析其对RD胚胎型横纹肌肉瘤细胞作用的效果，并与联合应用顺铂的效果进行对比，分析其作用机制。结果MTY法显示顺铂浓度为1．0μg／ml、5．0μg／ml和10．0μg／ml对RD细胞生长的抑制率分别为9．8％、23．4％和43．8％；按MOI值1000转染腺病毒Ad／GT-TRAIL对RD细胞生长的抑制率为41．2％，再联合Ad/PGK-GV16后，生长抑制率上升到52．5％；Ad／GT-TRAIL联合Ad／PGK-GV16再加用顺铂后的生长抑制率为72．7％。顺铂作用3d后的凋亡率为7．41％；Ad／GT-TRAIL联合Ad／PGK-GV16作用3d后的凋亡率为12．95％；Ad／GT-TRAIL联合Ad／PGK-GV16再加用顺铂作用3d后的凋亡率为23．24％，而1640对照组的凋亡率为2．19％。顺铂作用后，细胞的cFLIP mRNA表达下调，与细胞凋亡增加的改变相一致。结论 Ad／GT-TRAIL能有效诱导横纹肌肉瘤细胞的凋亡，从而抑制横纹肌肉瘤细胞的生长，联合应用顺铂后能显著提高疗效。     

TRALL联合IFN-γ诱导骨肉瘤细胞凋亡实验研究

目的观察干扰素(IFN)-γ协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的作用,初步探讨协同作用机制,并观察联合用药时对成纤维细胞的毒性作用。方法应用相差显微镜和电镜观察MG-63细胞经TRAIL、IFN-γ及TRAIL联合IFN-γ作用后细胞形态学变化;进行四唑盐比色试验观察不同实验组MG-63细胞和成纤维细胞抑制率;流式细胞仪观察细胞凋亡情况;逆转录-聚合酶链反应法观察IFN-γ作用后TRAIL膜受体表达情况。结果TRAIL联合IFN-γ应用时,随着IFN-γ作用时间的延长,细胞悬浮、空泡化等现象逐渐明显,且在作用24小时最为显著,电镜显示细胞凋亡的特征性变化;联合用药组细胞抑制率较单独TRAIL组增加,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组细胞凋亡率显著增加(P<0.01);应用IFN-γ前后,TRAIL死亡受体(DR)4的相对表达量增加,IFN-γ作用24小时表达量最大,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组对成纤维细胞的毒性,与单独TRAIL组相比没有显著增加(P>0.05)。结论IFN-γ可协同TRAIL诱导MG-63细胞凋亡,DR4表达量增加可能是协同作用的缘故。联合用药不会增加对成纤维细胞的毒副反应。     

白细胞介素12通过抑制survivin表达加强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的肝癌细胞凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肝细胞癌(HCC)的治疗作用,以及TRAIL耐药的可能机制和逆转耐药方案。方法 采用原位杂交方法观察HCC与正常肝组织中TRAIL的表达差异。采用不同浓度的sTRAIL(可溶性)处理HCC细胞株及真核表达质粒pIRES-EGFP-sTRAIL转染HCC细胞株,观察sTRAIL的抑癌疗效。建立裸鼠肝癌模型,观察sTRAIL的体内抑癌作用。进一步,检测HCC中survivin的表达并采用反义寡核苷酸封闭治疗。最后,观测sTRAIL和IL-12联合抗癌效果。结果 肝癌组织DR表达量显著强于正常肝组织DR表达量。60例肝癌组织中54例不表达诱捕受体DcRl,25例不表达DcR2,而20例正常肝组织均表达DcR。两种．HCC细胞株中DcR1表达缺失。经sTRAIL(100ng/ml)处理24h,HCC细胞凋亡发生率约10％,而Jurkat细胞凋亡率达70％以上。体外pIRES-EGFP-sTRAIL转染对肝癌细胞杀伤作用不敏感。体内直接瘤体注射pIRES-EGFP-sTRAIL可对裸鼠肝癌无明显抑制作用。HCC高表达survivin,反义寡核苷酸封闭可部分逆转TRAIL耐药。IL-12使survivin表达明显下调,显著加强TRAIL对HCC细胞的杀伤作用。结论 HCC对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象。survivin参与HCC对TRAIL的耐药机制,反义寡核苷酸封闭可部分逆转TRAIL耐药。IL-12可通过抑制siurvivin表达增强TRAIL对HCC杀癌作用。联合基因治疗(如TRAIL和IL-12基因)可能成为一种有前途HCC治疗方案。     

肿瘤坏死因子α对人肝癌多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对体外培养的人肝癌耐阿霉素细胞系（HepG2／ADM）多药耐药现象的逆转作用。方法不同浓度（100、500及2500U／ml）TNF-α作用于HepG2／ADM细胞72h后进行以下试验：用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测各组多药耐药相关基因（MDR1）及脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）基因的mRNA表达情况;用罗丹明外排法检测各组P-糖蛋白活性;用Annexin V检测0．5mg／L阿霉素诱导的各组细胞凋亡情况;利用MTF法检测各组耐药性的改变。结果TNF-α能诱导HepG2／ADM细胞的MDR1基因表达下调,PPAR-α基因表达上调,且能增加阿霉素诱导的凋亡细胞的比例及细胞毒作用。结论TNF-α可能分别通过抑制MDR1表达及促进PPAR-α表达而逆转HepG2／ADM细胞的耐药性。     

肿瘤坏死因子α逆转入肝癌多药耐药性的实验研究

目的 探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）作为多药耐药（ＭＤＲ）逆转剂,特别是作为多重ＭＤＲ逆转剂的作用及其机制,方法 用本单位建立的肝癌ＳＭＭＣ７２２１ＭＤＲ亚系列作为ＭＤＲ模型,用ＭＴＴ法观察了ＴＮＦα对ＭＤＲ的逆转作用,用ＲＴ－ＰＣＲ,流式细胞术观察ＴＮＦα对ＭＤＲ基因表达的影响,结果ＴＮＦα对ｍｄｒ１,ＬＲＰ,ＧＳＴＦ１和ＴｏｐｏⅡα基因介导的耐药性逆转率为８７．５２％－１００％,对ＭＲＰ基因介     

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是能够较特异性诱导肿瘤细胞凋亡的肿瘤坏死因子超家族成员 ,由于对正常组织不表现毒性[1] ,在肿瘤治疗方面得到广泛研究。我们对TRAIL诱导膀胱癌细胞EJ凋亡的作用进行了研究 ,现报告如下。材料与方法　重组人TRAIL(rhTRAIL)由KamiyaBiomedical公司制备和纯化 ,浓度设置为 10 0、5 0、2 0和 10ng/ml。Annexin V FluosStainingKit试剂盒购自罗氏公司。人膀胱癌EJ细胞用含 10 %小牛血清 ,10 0U/ml青霉素和10 0 μg/ml链霉素的RPMI 16 4 0 37℃、5 0ml/LCO2 、饱和湿度下培养。细胞按 5× …     

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)诱导膀胱癌细胞凋亡的效应。方法 10～100μg／L梯度浓度的TRAIL与培养的EJ细胞共孵育4～24h。采用Annexin V染色，DNA云梯实验和流式细胞技术检测诱导后EJ细胞凋亡发生的时期和程度。结果 TRAIL诱导4h即后可观察到早期细胞凋亡发生，8h后即可检测DNA片段化，24h后凋亡细胞最多达到66．29％。结论 TRAIL能够迅速诱导EJ细胞凋亡，可能成为膀胱癌治疗的新方法。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合阿霉素治疗骨肉瘤

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与阿霉素（ADM）联用对骨肉瘤细胞株HOS是否具有协同杀伤作用，并对其机制进行初步研究。方法 MTT法检测细胞的抑制率和存活率，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测TRAIL受体（receptor，R）的表达水平。结果 单用0．5mg／LTRAIL及1．0、10．0、100．0mg／LADM对HOS8603的抑制率分别为13．18％、5．56％、23．02％和76．72％，联合用药的抑制率分别为42．98％、53．12％、81．91％。0．5mg／LTRAIL和1．0mg／LADM有协同作用．TRAIL和ADM联用时TRAIL R2 mRNA表达较TRAIL单用时明显增强。结论 TRAIL与ADM联用对骨肉瘤细胞有明显的协同作用，其机制可能与ADM上调TRAILR2的表达有关。     

TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究

目的构建TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的真核表达质粒，观察其对BALB／c裸鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的抑瘤作用。方法提取U937细胞总RNA．用RT-PCR方法扩增出胞外区(114—281aa)，连入溶菌酶信号肽序列，构建分泌型TRAIL重组质粒；建立裸鼠7402肝癌细胞皮下移植瘤模型，纯化后的质粒DNA与脂质体聚乙烯胺混合后经肌肉注射进行基因转染，体内验证重组蛋白的抑瘤活性，采用TUNEL法进行肿瘤组织细胞凋亡检测。结果肿瘤体积测定结果显示．TRAIL对肝癌细胞生长有抑制作用；凋亡检测光镜下可见有棕褐色凋亡细胞，细胞凋亡指数增高。结论重组TRAIL质粒能引起肿瘤细胞的凋亡，抑制7402肝癌细胞的生长。     

丝裂霉素诱导人肝癌细胞凋亡的研究

本研究旨在观察在体外丝裂霉素(ＭＭＣ)对人肝癌细胞凋亡的诱导作用 ,从凋亡的角度探讨其抗癌机理 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.细胞培养及实验分组 :人肝癌ＢＥＬ 740 2细胞株来自中国科学院上海细胞所 ,用含高糖的ＤＭＥＭ培养液 ,补充体积分数为 12 %的胎牛血清、青霉素 (10 4 Ｕ/Ｌ)、键霉素 (10 0 μｇ/Ｌ) ,于37℃ ,体积分数为 5 %的ＣＯ2 孵箱中培养。实验分药物处理组与对照组 ,处理组又分 2× 10 -2 、2× 10 -3 、2× 10 -4 ｇ/ＬＭＭＣ 3种浓度 ,作用时间为 2 4ｈ。2 .透射电镜 :将浓度为 2× 10 -2ｇ/Ｌ的ＭＭＣ处理Ｂ…     

mda-7/IL-24联合阿霉素诱导裸鼠肝癌凋亡的初步研究

目的:探讨重组腺病毒介导的mda-7/IL-24基因联合阿霉素（ADM）治疗裸鼠肝癌的作用及机制。方法:采用mda-7/IL-24的重组腺病毒载体（Ad-mda-7）和/或ADM治疗实验性肝癌裸鼠，观察各组裸鼠生长时间及肿瘤体积变化，并对各组瘤体组织进行TUNEL检测。结果:成功构建了重组腺病毒mda-7/IL-24基因载体。Ad-mda-7＋ADM联合治疗组裸鼠平均生存时间为（83.8±4.82）d，明显长于其他3组（P<0.01）;Ad-mda-7＋ADM组肝癌体积明显缩小，抑癌率为79.78%，与单独用药组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;联合组癌组织凋亡增加，凋亡指数为38.1%±4.2%，与其余3组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:重组腺病毒介导mda-7/IL-24联合阿霉素有明显的协同抗肿瘤作用，效果优于单独治疗组，主要作用机制与促进癌组织凋亡有关。