化学萃取同种异体神经种植许旺细胞的体外实验

目的：通过自体许旺细胞与化学萃取同种去细胞异体神经桥接物体外结合培养的研究，寻找一种在结构功能上与自体神经相似而抗原性少或无的物质来修复较长距离的神经缺损。方法：使用近交系F344乳鼠和双差速贴壁及Arab-C抑制成纤维细胞生长的细胞培养方法来获得大量纯度的许旺细胞。成年SD大鼠作为异体神经来源，利用化学萃取去除其中细胞成分降低其抗原性，制备去细胞神经桥接物，再把前者通过微注射方法注入到后者内部继续培养观察细胞生长情况。用抗S-100标记许旺细胞计算纯度，用HE染色、电镜观察神经萃取及细胞种植其内后生长情况。结果：许旺细胞培养纯度达92%以上。Triton-X-100及脱氧胆酸钠具有完全萃取掉神经纤维中的许旺细胞及髓鞘，萃取后所得到的桥接物适合于许旺细胞体外生长，并且细胞在其内有迁移排成行的特性。结论：通过化学萃取方法所得到的异体去细胞神经桥接物种植自体许旺细胞后可能为一种理想的神经缺损修复材料。     

种植脂肪干细胞的去细胞神经修复坐骨神经缺损的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)应用于组织工程化外周神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只体重200～220 g的雌性F344大鼠随机分成6组,每组8只,分别用下面6种不同的实验组修复15 mm长坐骨神经缺损.A组:种植ADSCs的去细胞神经;B组:种植诱导ADSCs的去细胞神经;C组:种植许旺细胞(SCs)的去细胞神经;D组:去细胞神经;E组:自体神经移植;F组:空白对照.通过神经电生理检测、荧光金逆行示踪、组织学检测和坐骨神经功能指数测定评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后12周,F组未见桥接物,A组和B组的神经电生理等各项指标均分别优于D组(P＜0.05或P＜0.01),与C组和E组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初步结果显示ADSCs及诱导后ADSCs作为种子细胞,与去细胞神经构建的组织工程化外周神经移植体,能够修复外周神经缺损.     

成年大鼠许旺细胞复合去细胞神经支架修复坐骨神经缺损

目的  探讨成年许旺细胞(SC)复合去细胞神经支架构建的组织工程化人工神经移植治疗外周神经损伤的效果。方法  从Wallerian变性1周的成年SD大鼠远侧端神经中分离培养得到SC, 复合去细胞神经支架构建组织工程化人工神经。移植分为SC+去细胞SD大鼠神经支架组(SC治疗组)和空细胞SD大鼠神经支架组(阴性对照组), 每组各5只。比较两组大鼠术后2、4、8周损伤侧坐骨神经功能指数(SFI), 术后8周损伤侧坐骨神经传导功能和小腿三头肌湿重恢复率等修复效果的指标。结果  SC治疗组术后2、4、8周损伤侧SFI, 术后8周损伤侧坐骨神经传导功能和小腿三头肌湿重恢复率均优于或高于阴性对照组(均为P < 0.05)。结论  采用成年SC复合去细胞神经支架的人工神经移植治疗外周神经缺损, 可有效促进损伤神经的功能恢复。     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

类许旺细胞种植入去细胞神经桥接物后体内外标记示踪及神经功能恢复检测

目的 将类许旺细胞种值入去细胞神经桥接物内后观察体外培养下细胞存活情况及体内桥接坐骨抻终缺损后细胞存活情况及对神经功能恢复的影响。方法 通过Dezawa改良法诱导的类许旺细胞经Hochest 33342标记以10^7／ml显微注入经化学萃取的神经桥接物内，分别体外培养0、5、10、15、20、30d，苏木精-伊红染色及荧光硅微镜观察细胞在侨接物内的存活情况。同时将该神经桥接物桥接2cm长的坐骨神经缺损模型，分别于5、10、15、20、30、40d取材，观察细胞在桥接物内的存活情况、再生轴突的生长速度及再生轴突有髓纤维密度；于第30、50、70d进行神经电生理检测；于第40、60、80d进行坐骨神经功能指数测定，同时将无细胞的单纯神经桥接物桥接坐骨神经缺损及自体坐骨神经切断后原位缝合分别作为对照。结果 类许旺细胞在体内外条件下均能在化学萃取后的去细胞神经桥接物中存活。体内环境可能更有利于类许旺细胞的增殖。种植类许旺细胞的实验组各测定指标明显优于无细胞桥接对照组（P〈0．05或P〈0．01），实验组与自体神经对照组各指标近似（P〉0．05）。结论 类许旺细胞种植入去细胞神经桥接物后在体内外环境均能存话；种入类许旺细胞的去细胞神经桥接物桥接神经缺损可达到近似自体神经移植桥接的效果。     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究

[目的]研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。[方法]切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在5．0％Triton X-100和5．0％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S-100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。[结果]去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8cm移植组明显高于10cm移植组（P〈0．05）。组织学检查显示8cm移植组再生的神经轴突通过移植段神经到达远侧的神经中，并与所支配的肌肉建立新的运动终板联系，坐骨神经支配的小腿三头肌中有大量新生的运动终板形成。在10cm移植组有部分再生的神经纤维通过移植段神经进入远端的神经，小腿三头肌中新生的运动终板数量和大小明显低于8cm移植组（P〈0．05）。[结论]在化学去细胞神经的制备中，神经的长度对去细胞的质量无影响；化学去细胞异体神经修复神经缺损的长度若不超过8cm可取得较满意的功能康复结果。     

去细胞同种异体神经移植修复周围神经缺损临床安全性研究

目的 探讨化学去细胞同种异体神经移植修复人体周围神经缺损的临床安全性.方法 从2002年3月至2011年1月,取成年遗体捐献者的周围神经,使用化学萃取法制备去细胞同种异体神经,将其消毒、储存,并用于临床治疗41例周围神经缺损患者.男性38例,女性3例,年龄10～55岁.受伤至神经修复时间10 h至9个月,平均4.1个月.受损神经包括臂丛神经10例,上臂桡神经3例,前臂尺神经4例,指(趾)神经12例,坐骨神经2例,胫神经3例,腓总神经5例,股神经2例.合并骨折12例,合并软组织损伤或缺损20例.神经桥接长度2～10 cm,平均6.1 cm.术后不使用免疫抑制药物.术后随访9～5l个月,平均20.2个月.通过手术部位物理检查及血生化和免疫检测以评价移植的安全性.结果 术后患者全部得到随访,39例伤口一期愈合,2例发生表浅感染,经换药后延迟愈合.所有患者均未发生免疫排斥反应、过敏性反应、深部感染、肝肾毒副作用等不良反应.术后1、12周血生化检测均正常,特种蛋白、淋巴细胞亚群等免疫检测指标术前、术后差异无统计学意义.结论 临床上采用去细胞同种异体神经移植修复人体周围神经缺损是安全的.     

带蒂神经植入脊髓后许旺细胞的存活与迁移

目的：探讨神经组织移植后许旺细胞存活、增殖及诱导轴突再生的能力。方法：成鼠胸髓损伤后,分别移植带血管蒂正中神经（VN组）和游离正中神经（PN组）,术后8周行组织学检查和形态计量分析。结果：带血管蒂正中神经组移植神经与脊髓连接紧密,有较多新生轴突,许旺细胞大量存活和增殖,NF,S－100阳性反应均明显高于游离正中神经组。结论：带血管蒂周围神经移植较接近生理状态,许旺细胞存活并向脊髓实质内迁移和大量增殖,其诱导损伤轴突再生的能力也优于游离周围神经移植。     

优化法去细胞大鼠神经同种异体移植修复坐骨神经缺损

[目的]以优化法去细胞大鼠神经移植,修复同种异体坐骨神经缺损,观察术后动物的免疫排斥、早期功能恢复及神经再生情况。[方法]以优化去细胞方法处理新鲜取材的成年SD大鼠坐骨神经,移植修复同种异体1.0cm坐骨神经缺损,以自体神经和新鲜异体神经移植为对照,术后1个月行坐骨神经功能指数评价、神经电生理和组织学检查,观察动物在功能恢复、免疫排斥及神经再生方面的情况。[结果]自体神经和去细胞异体神经移植组动物的坐骨神经功能指数无显著差异(P>0.05),大体观察均可见神经连续性良好。电生理检测表明2组动物移植神经均已恢复电传导能力,在传导速度(CV)上无显著差异(P>0.05),但均未达到正常神经水平(P<0.05)。组织学观察则显示2组再生神经纤维均已长入移植段远端。S-100免疫组化显示两者在雪旺氏细胞数、形态和排列等方面无明显差异。2组在CD8 T细胞和巨噬细胞免疫组化染色阳性面积百分比上差异无统计学意义(P>0.05)。计算移植神经中段轴突密度后表明两者无显著差异(P>0.05),但都比正常神经小(P<0.05),比新鲜异体神经移植组大(P<0.05)。[结论]优化去细胞神经移植组与自体神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面无显著差异。优化法去细胞神经在移植修复同种异体神经缺损时,可以达到免疫耐受,其早期功能恢复和神经再生情况良好,在修复周围神经缺损时可以作为自体神经移植的一种替代疗法。     

雪旺氏细胞植入硬脊膜管修复周围神经缺损的实验研究

本文报道两组10mm大鼠坐骨神经缺损,分别用含雪旺氏细胞和不含雪旺氏细胞的硬脊膜管桥接修复,术后2、4个月行光镜、电镜、神经电生理和计算机图像分析检测,证实植入雪旺氏细胞者,再生神经生长及成熟较早,肢体功能恢复较快,雪旺氏细胞和硬脊膜管结合,对周围神经再生有更大的促进作用。     

雪旺细胞移植与周围神经再生

广泛阅读近年来有关人工神经方面的文献，重点了解桥接神经的移植体和雪旺细胞移植方面的研究进展。自体材料，异体材料和合成材料均可作为桥接神经缺损的神经导管，以化学萃取的同种异体神经较为理想，雪旺细胞体外纯化和培养后仍具有生物活性，用微注入法把雪旺细胞植入移植物内可促进神经轴突的再生。理想的人工神经应由有特定的三维结构的生物材料和有生物活性的雪旺细胞构成，雪旺细胞在支架内有序的分布，类似于Bungner带。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺氏细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的　从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法。方法　成年Wister大鼠 4 8只 ,平均分为 3组。切断大鼠坐骨神经并形成 10mm长缺损 ,用硅胶管桥接两侧断端 ,管腔内植入胶质细胞源性神经营养因子 (glialcell linederivedneurotrophicfactor,GDNF)修饰的雪旺氏细胞 (schwanncells,SCs) ,正常SCs修复组和单纯硅胶管修复组作为对照 ,分别于术后 4、8、12和 16周对各组动物进行大体观察 ,肌电图测量 ,组织学切片观察 ,再生神经的神经电生理检测 ,GDNF免疫组化检测 ,组织学切片 ,观察和图像分析。结果　GDNF SCs组动物的神经传导速度、有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度均显著优于SCs组和硅胶管组。结论　将GDNF基因修饰的雪旺氏细胞移植修复周围神经缺损 ,使局部释放的GDNF维持神经元存活 ,加快轴突再生速度以促进周围神经再生 ,此方法为将来治疗周围神经损伤提供了线索。     

Repairing peripheral nerve defects with tissue engineered artificial nerves in rats

Objective： To observe the effect of tissue engineered nerves in repairing peripheral nerve defects （ about 1. 5 cm in length） in rats to provide data for clinical application.
Methods： Glycerinated sciatic nerves （2 cm in length） from 10 Sprague Dawiey （SD） rats （aged 4 months） were used to prepare homologous dermal acellular matrix. Other 10 neonate SD rats （aged 5-7 days） were killed by neck dislocation. After removing the epineurium, the separated sciatic nerve tracts were cut into small pieces, then digested by 2.5 g/L trypsin and 625 U/nd collagenase and cultured in Dulbecco＇ s modified Eagle＇ s medium （DMEM） for 3 weeks. After proliferation, the Schwann cells （SCs） were identified and prepared for use. And other 40 female adult SD rats （ weighing 200 g and aged 3 months） with sciatic nerve defects of 1.5 cm in length were randomly divided into four groups： the defects of 10 rats bridged with proliferated SCs and homologous dermal acellular matrix （the tissue engineered nerve group, Group A）, 10 rats with no SCs but homologous dermal acellular matrix with internal scaffolds （Group B ）, 10 with autologous nerves （Group C ）, and the other 10 with nothing （the blank control group, Group D）. The general status of the rats was observed, the wet weight of triceps muscle of calf was monitored, and the histological observation of the regenerated nerves were made at 12 weeks after operation.
Results： The wounds of all 40 rats healed after operation and no death was found. No foot ulceration was found in Groups A, B and C, but 7 rats suffered from foot ulceration in Group D. The triceps muscles of calf were depauperated in the experimental sides in all the groups compared with the uninjured sides, which was much more obvious in Group D. The wet weight of triceps muscle of calf and nerve electrophysiologic monitoring showed no statistical difference between Group A and Group C, but statistical difference was found between Groups A and B and Groups B and     

嗅鞘细胞与雪旺细胞修复神经缺损的效果比较

目的 比较雪旺细胞和嗅鞘细胞修复周围神经损伤的能力. 方法体外培养异体雪旺细胞及嗅鞘细胞2周后纯化浓缩待用.60只成年雌性Wistar鼠随机分成三组,坐骨神经切除25 mm长轴突,保留神经外膜吻合于近端,分别将细胞培养液、雪旺细胞、嗅鞘细胞分别植入A、B、C组神经外膜腔内,术后3个月,通过大体形态观察、显微镜及透射电镜观察、逆行标记荧光红的运输距离、免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白及神经生长因子、踝关节功能评分、酶联免疫方法检测髓鞘碱性蛋白及神经丝蛋白来评估神经缺损的修复效果. 结果神经缺损再生情况,肉眼观C组最完全,B组次之,而A组最差,光学显微镜及透射电镜观察神经纤维生长情况、荧光显微镜下观察逆行标记荧光红在神经中的运行距离,C组最长,B组次之,而A组最短;免疫荧光检测神经生长因子及胶质纤维酸性蛋白浓度、酶联免疫吸附实验检测髓鞘碱性蛋白及神经丝蛋白浓度均数、踝关节运动功能评分均数的结果都是C组最高,B组次之,而A组最低,三组间差异有统计学意义(P<0.05). 结论嗅鞘细胞能促进神经缺损再生,且效果优于雪旺细胞.     

三种脱细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损效果的比较

目的 比较三种去细胞神经支架修复大鼠坐骨神经缺损效果差异.方法 取大鼠坐骨神经39条,分别用甘油(A组)、叠氮钠(B组)、三硝基甲苯(C组)萃取,每组13条.观察萃取神经结构.用A、B、C三组神经支架修复1.5 cm长的SD大鼠坐骨神经缺损,另设自体神经移植组(D组)和空白对照组(E组),每组10只,术后12周比较五者的修复效果.结果 萃取后A组90%细胞、B、C100%细胞消失,纤维性支架结构A组95%完整;而B、C组仅30%.修复后小腿三头肌湿重、神经电生理A、B、C三组修复大鼠坐骨神经缺损效果相当(P＞0.05),与D、E组比较(P＜0.05)、差异有统计学意义.结论 甘油、叠氮钠、三硝基甲苯等萃取神经可较好地修复坐骨神经缺损,但甘油处理神经最为简单.     

自体雪旺细胞促周围神经端侧吻合轴突侧支发芽的实验研究

目的：研究周围神经损伤行端侧吻合口自体雪旺细胞（Sc)移植对端侧吻合的作用，探讨改善端铁合质量的方法。方法：72只Wistar大鼠随机平均分为3组：A组，左腓神经端端吻合组；B组，左胫腓神经端侧吻合组；C组，左胫腓神经端侧吻合后再生小室内注自体雪旺细胞悬液组。于术后2、4、6个月每组分别取8只大鼠取材、检测，依次行大体观察、神经电生理检测、肌湿重、组织学及电镜观察等。结果：C组与B组各项指标比较：肌力、肌纤维截面积、有髓纤维截面积差异有显著性（P＜0．05）。神经电生理、肌湿重、有髓纤维数目差异有非常显著性（P＜0．01），显示恢复较好，某些指标（神经电生理、肌湿重、肌纤维截面积）在6个月时接近A组（P＞0．05）。结论：自体雪旺细胞移植可以促进周围神经端侧吻合轴突侧支发芽，改善端侧吻合口质量。     

组织工程神经在修复周围神经缺损中的应用

周围神经缺损的修复与重建是当前神经领域的一大难题。目前，国内外学者已着力研究雪旺细胞和生物材料复合构建组织工程化人工神经，并将其与日益完善的显微外科技术结合起来，提高周围神经损伤的修复水平。本文结合国内外研究成果，对周围神经损伤修复的研究进行回顾，着重从组织工程方面阐述周围神经修复方法的现状与前景。