抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

目的 利用基因重组技术构建ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体基因并使其在大肠杆菌中永生化和表达活性的抗ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体（ＳｃＦｖ），方法和结果 利用基因重组技术，在构建抗ＨＢＶ前Ｓ２３Ｂ９ＳｃＦｖ基因的基础上，在此基因中引入限制性同切酶位点，克隆到噬菌体表达载体－ｐＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中，经亲和筛选得到２株阳性重组克隆，诱导表达产物在特异性阻断ＥＬＩＳＡ实验中具有一定阻断亲本３Ｂ９单抗与ＨＢＶ前Ｓ２抗原的结     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库.方法 分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA.用相应引物进行PCR,扩增出轻链和重链Fd段基因,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XLl-Blue菌株.将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中.结果 从分离出的淋巴细胞中提取到高质量RNA,RT-PCR分别扩增出约680 bp大小的κ、λ和Fd基因.PCR 产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,轻链K、κ、λ和重链Fd基因均插入pComb3的重组率为50%.结论 构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,为筛选大肠癌相关抗体打下基础.     

噬菌体展示技术的原理及应用

0 引言 1985年Smith首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别。1988年Parmley et al将已知抗原决定族与p Ⅲ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想。1990年McCafferty et al地报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代。     

抗-HBs的人源性噬菌体抗体库的构建

目的构建含抗－ＨＢｓ的人源性噬菌体抗体库。方法用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从自然感染的抗－ＨＢｓ阳性的两名献血员的外周血淋巴细胞中,扩增出人抗体轻链Ｋ基因和重链Ｆｄ基因,将二基因先后克隆人ＰＣｏｍｂ３Ｈｓｓ载体中,转化大肠杆菌,再用辅助噬菌体感染。结果构建了库容量为１５×１０５的轻链基因抗体库,轻链基因插人率为５７％和库容量为５×１０５的人Ｆａｂ体库,轻、重链基因插人率为５０％。经辅助噬菌体感染,得到噬菌体滴度为５×１０１４ＣＦＵ／ｍｌ的人源性噬菌体抗体库。结论成功构建了合抗－ＨＢｓ的人源性噬菌体抗体库,为进一步筛选ＨＢｓＡｇ的人Ｆａｂ噬菌体抗体奠定了基础。     

噬菌体表面呈现技术及其在疟疾免疫中的应用

噬菌体表面呈现技术是将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ或基因Ⅷ,使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合并呈现在噬菌体表面,用亲和选择筛选出表达特异多肽或蛋白质的噬菌体,测定插入噬菌体DNA序列,确定所呈现的多肽或蛋白质的氨基酸序列。本文介绍了该技术的建立及其在疟疾免疫方面的应用。     

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体

目的从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。方法用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。结果第三轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第一轮增加80倍,含有抗体轻链基因和重链基因的克隆,也由淘筛前的17%增至100%,经ELISA证实,筛选到的抗HBsAg噬菌体抗体对HBsAg具有良好的结合活性,而与牛血清白蛋白和HAVAg等无关抗原均不反应。结论HBsAg对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗HBsAg的单克隆抗体的噬菌体。     

丝状噬菌体感染宿主早期的相互作用机制

自Twort和Herelle分别与1915和1917年各自独立发现噬菌体以来,对噬菌体及噬菌体-宿主相互作用的研究也越来越深入。噬菌体不仅在细菌基因水平转移的过程中发挥着重要的作用,而且,噬菌体治疗也有成功应用于临床人体感染的案例,这为解决细菌耐药性的问题提供了一条新思路。     

化脓性链球菌毒力演化的载体——噬菌体

化脓性链球菌等细菌会因基因变异,导致毒力增强。长期以来,左右基因变异的因素一直是科学家所关注的热点。由于噬菌体与其宿主菌的密切关系,推测其在细菌的演化过程中发挥了重要作用。M1T1菌株虽在侵袭性感染和非侵袭性感染中均可普遍分离获得,但与严重的侵袭性感染似乎有着更紧密的联系。基因水平的研究发现,该菌株的高毒力可能与前噬菌体有关,     

噬菌体表面呈现技术及其在疟疾免疫中的应用

噬菌体表面呈现技术是将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ或基因Ⅷ，使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合并呈现在噬菌体表面，用亲和选择筛选出表面特异多肽或蛋白质的噬菌体，测定插入噬菌体ＤＮＡ序列，确定所呈现的多肽或蛋白质的氨基酸序更。本介绍了该技术的建立及其在疟疾免疫方面的应用。     

利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展

1985年,美国Missouri大学的SmithGP将外源基因插入丝状噬菌体（Filamentous bacteriophage,fd）的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术。1994年McCaffery等最先构建了噬菌体抗体展示文库,开始了噬菌体展示技术应用的新时代。十多年来,噬菌体展示技术被用于蛋白质、多肽（如抗体、酶）的制备,主要应用于医学、生物、食品等领域。     

抗日本血吸虫循环抗原噬菌体抗体基因结构分析

目的 对获得的抗日本血吸虫循环抗原的抗体克隆进行基因分析。方法 将2株阳性克隆抗体基因进行测序，并用NCBI和Ig Blast Analysis of lmmunoglobulin sequences中的软件，对DNA序列和由其推导的氨基酸序列进行分析，并对其二级结构进行了模拟。结果 B04和C24阳性克隆抗体基因的长度分别为708bp和732bp，轻链和重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白基因有高度的同源性。推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征。对2株克隆抗体基因二级结构进行模拟，结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构，均符合抗体的基本构型。结论 B04、C24阳性克隆外源基因均属于小鼠免疫球蛋白可变区基因。     

轻链替换提高抗HBsAg噬菌体抗体的结合力

通过轻链替换,提高抗ＨＢＳＡｄｅ菌体抗体的结合力。方法将ＰＣＲ扩增的人抗体轻链基因,插至已克隆有人源抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体重链Ｆｄ基因的噬菌粒中,构建成轻链替换文库,通过亲和淘洗,筛选与Ｆｄ相匹配的轻链基因。结果经亲和淘洗后,筛选出了与Ｆｄ相匹配的轻链基因,链替换后,噬菌体抗体（ＰｈＡｂ）的ＥＬＩＳＡ光吸收值（Ａ）从０．４３±０．０９提高到最高为１．２４±０．１０。抑制实验证实所筛选出来的ｎｈａｂ具有抗ＨＢｓＡｚ的特异性。分析了ＥＬＩＳＡ光吸收值（Ａ）最高的５株噬菌体抗体的轻链基因序列,结果表明,３株ｋ链的碱基序列一致,属ＶｋⅢ亚群;２株链的基因序列相同,均属ＶＩ亚群。结论结果表明经链替换的噬菌体抗体结合力得到了较大提高,并具有与ＨＢｓＡｇ合的特异性。     

用噬菌体肽库筛选配体及其用途

外源多肽能够在丝状噬菌体表面表达,是Smith等人于1980年第一次报道的。当把外源多肽核酸序列插入到丝状噬菌体外壳P3或P8基因中后,感染宿主菌,P3或P8蛋白氨基端就可以表达出多肽,并且该噬菌体依然具有侵染宿主菌的能力。在此后的二十年里此项研究已发展成为噬菌体肽库的表达,克隆好的噬菌粒经转化进入宿主     

噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用

198 5年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区 ,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面 ,并建立了噬菌体表面呈现技术 (Phagedisplaytechniques)。在此基础上 ,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合 ,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达 ,并呈现在噬菌体表面 ,从而建立了噬菌体随机肽库技术 (Phagedisplayrandom peptidelibraries)。近年来 ,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的…     

噬菌体展示技术及其在弓形虫研究中的应用

将病原体的免疫原与λ噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合后一起展示于病毒表面 ,这样形成的新的病毒颗粒可用作疫苗。Smith[1] 通过基因工程手段将外源基因插入到丝状噬菌体的PIII蛋白基因中 ,成功地使外源多肽展示在噬菌体的表面 ,而且用抗体检测发现该外源多肽具有同天然产物相同的生物活性。这标志着噬菌体展示技术的诞生。而Geysen等[2 ] 认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的功能位点 ,而且多数情况下 ,几个关键残基与其受体所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分。这就为噬菌体展示技术奠定了理论基础。1　噬菌体展示技术噬…     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

布鲁氏菌噬菌体基因组学研究进展北大核心CSCD

布鲁氏菌噬菌体用于鉴定和鉴别布鲁氏菌种属,其种类、遗传特性以及基因组功能对布鲁氏菌鉴别分型具有重要作用,因此布鲁氏菌噬菌体的研究备受关注。基于当前的研究进展,本文对布鲁氏菌噬菌体的基本特征、基因组功能、基因组比对以及最新应用技术的相关研究进行综述,在了解布鲁氏菌噬菌体基因多样性和复杂性的基础上,进一步认识噬菌体与宿主的相互作用机制。     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬菌体抗体库的初建

目的 建立抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬体抗体库,为进一步获得功能性抗体可变区基因,制备单链抗体和单链抗体－辣根过氧化物酶融合蛋白,用于甲状腺自身免疫性疾病的治疗和检测打下基础,方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗甲状腺刺激性免疫球蛋白的杂交瘤细胞中扩增出轻重链可变区基因,与噬粒表达载体ｐ３ＳＣＭＨ连接,转化大肠杆菌,以甲状腺刺激性免疫球蛋白阳性患者血清ＩｇＧ为抗原对表达的噬菌体抗体进行筛选,结     

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的 构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础. 方法 从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库. 结果 成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达107. 结论 以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体.     

噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20 个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆, 包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28 S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因. 结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前- S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.