束缚应激上调小鼠脾脏淋巴细胞钾离子通道（Kvl．3）的表达

目的观察束缚应激条件下小鼠脾脏细胞Kvl．3表达的变化。方法采用RT—PCR、Western blot等分子生物学及免疫组化实验方法，分别从基因和蛋白质水平揭示束缚应激对小鼠脾脏细胞Kvl．3表达的调节。结暴束缚应激16h后小鼠脾脏细胞Kvl．3 mRNA和蛋白质表达水平明显上调（P〈0．05）。但是。相同束缚应激条件下小鼠脑组织Kvl．3表达无明显变化（P〉0．05）。结论束缚应激状态下小鼠脾脏细胞Kvl．3 mRNA和蛋白质表达水平呈明显组织特异性上调．提示束缚应激条件下免疫功能的调节可能与钾通道有关。这为进一步研究神经内分泌系统调节淋巴细胞功能的机制提供了新的思路。     

整合素信号通路可能参与大鼠束缚应激后的恢复过程(英文)

目的筛选与束缚应激大鼠应激反应恢复速度相关的基因,探讨应激反应个体恢复的分子机制。方法观察大鼠2小时束缚应激后血浆促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic-hormone,ACTH)及皮质酮的变化规律,根据应激结束后1小时的血浆ACTH及皮质酮下降程度将大鼠分为快速恢复组与慢速恢复组。采用微阵列技术检测快速恢复组与慢速恢复组下丘脑组织基因表达的差异,用实时逆转录-聚合酶链反应验证部分基因的表达差异。结果基因芯片分析结果显示:大部分基因在两组间并无差异表达,在11个差异表达的基因中,快速恢复组中参与整合素信号通路的踝蛋白(talin)、整合素α6和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1β催化亚基(serine/threonine pro-tein phosphatase PP1-beta catalytic subunit,PP1B)基因有1.5倍上调,而结合粘附分子1(junctional adhesion mol-ecule 1, F11r)基因有 1.5 倍下调。实时逆转录 - 聚合酶链反应结果与芯片分析结果一致。结论本研究构建了束缚应激大鼠恢复过程的下丘脑基因表达谱,结果提示整合素信号通路可能参与应激的恢复过程。     

束缚应激血清对免疫细胞功能的影响

应用空斑形成细胞（PFC）方法观察体外免疫脾细胞在应激血清作用下，分泌抗体的能力并与正常血清进行比较，结果表明免疫脾细胞在应激血清作用下分泌抗体的能力与对照组间差异无显著意义；但是应激血清可抑制脂多糖（LPS）刺激的淋巴细胞转化反应，且有量效关系。应用ConA活化的脾细胞制成IL－2反应细胞，在加入应激血清及正常对照血清作用下，观察IL－2反应细胞对重组基因IL－2（rIL－2）的反应性变化发现，当应激血清与rIL－2同时加入培养基时，IL－2反应细胞的增殖效应与对照组间差异无显著性意义；但是预先将应激血清与ConA活化的脾细胞混合培养2h后，再加入rIL－2，在应激血清作用下IL－2反应细胞对rIL－2刺激的反应性则较对照组显著降低；不同稀释度的应激血清的抑制作用也相应不同。说明应激血清可抑制ConA活化的脾细胞对IL－2刺激的反应性。     

雌激素在慢性束缚应激性抑郁发生中的作用(英文)

目的探讨雌激素和kalirin-7在慢性束缚应激性抑郁发生中的作用。方法采用慢性束缚应激性抑郁动物模型,运用强迫游泳测试和免疫组织化学方法,分别检测动物行为学表现及海马中kalirin-7蛋白的表达。结果慢性束缚应激能显著降低动物体重、延长游泳不动时间、抑制海马中kalirin-7蛋白的表达。注射雌激素能明显改善动物抑郁样行为,并且海马kalirin-7表达显著增加。结论慢性束缚应激能诱发产生抑郁样行为,而雌激素替代疗法则能预防慢性束缚应激性抑郁的发生。此外,kalirin-7在防止慢性束缚应激性抑郁的发生中起到重要作用。     

整合素信号通路可能参与大鼠束缚应激后的恢复过程

目的筛选与束缚应激大鼠应激反应恢复速度相关的基因,探讨应激反应个体恢复的分子机制。方法观察大鼠2小时束缚应激后血浆促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic-hormone,ACTH）及皮质酮的变化规律,根据应激结束后1小时的血浆ACTH及皮质酮下降程度将大鼠分为快速恢复组与慢速恢复组。采用微阵列技术检测快速恢复组与慢速恢复组下丘脑组织基因表达的差异,用实时逆转录-聚合酶链反应验证部分基因的表达差异。结果基因芯片分析结果显示：大部分基因在两组间并无差异表达,在11个差异表达的基因中,快速恢复组中参与整合素信号通路的踝蛋白（talin）、整合素α6和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1β催化亚基（serine/threonine pro-tein phosphatase PP1-beta catalytic subunit,PP1B）基因有1.5倍上调,而结合粘附分子1（junctional adhesion mol-ecule 1, F11r）基因有 1.5 倍下调。实时逆转录 - 聚合酶链反应结果与芯片分析结果一致。结论本研究构建了束缚应激大鼠恢复过程的下丘脑基因表达谱,结果提示整合素信号通路可能参与应激的恢复过程。     

癫痫持续状态后大鼠海马区钾离子通道Kv1.3的表达研究

目的研究氯化锂-匹罗卡品致癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后大鼠海马区钾离子通道Kv1.3的表达及分布变化,探讨钾离子通道Kv1.3与癫痫发作的相关性。方法 48只健康雄性sprague-dawley大鼠随机平分为实验组和对照组,每组继续随机分为6 h、1 d、2 d和3 d 4个观察时间点亚组(n=6)。通过大鼠脑电监测记录大鼠脑电变化情况,通过尼氏染色观察脑组织病理改变,采用免疫组织化学染色和Western-blot方法检测各时间点大鼠海马区Kv1.3的表达及分布变化。结果 (1)脑电监测:正常大鼠脑电图表现为波幅较均匀一致的α波,痫性发作后开始出现慢波、棘波,波幅、节律不规则,SE过程中表现为长程的棘波活动。(2)尼氏染色:SE后6 h未发现明显形态学及神经元数量改变;SE后1 d,海马区神经元结构松散,神经元数量减少;SE后2 d、3 d,海马区神经元进一步减少,且出现神经元肿胀、变形、尼氏小体减少甚至消失。(3)免疫组织化学染色和Western-blot检测:SE后2 d,Kv1.3在海马CA_3和CA_1区表达较对照组明显减少(P0.05)。SE后6 h、1 d、3 d,Kv1.3在海马CA_3和CA_1区表达较对照组无明显变化(P0.05)。SE后6 h、1 d、2 d、3 d,Kv1.3在海马DG区表达较对照组无明显差异(P0.05)。结论 Kv1.3的表达下调可能与癫痫发作相关。     

小鼠脾脏树突状细胞的体外扩增与培养

背景：脾脏来源的树突状细胞诱导周期长，产量相对较少，相关报道亦较少。 目的：建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞形态学观察实验，于2007-02/09在华北石油总医院中心实验室完成。 材料：健康BALB/C小鼠、C57小鼠及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4。 方法：无菌手术取C57小鼠脾脏，用1 mL注射器抽取Hanks液，刺入脾脏并反复冲洗，获取单个核细胞，用0.1 g/L粒-单核细胞集落刺激因子、白细胞介素4的H-DMEM培养，8 d后即得成熟的树突状细胞。同时无菌取BABL/C小鼠脾脏制备单细胞悬液，收集非黏附细胞调整密度后作为反应细胞。再将两种细胞混合培养。 主要观察指标：成熟树突状细胞的形态学观察，并对其表面CD11c，CD86及MHC-Ⅱ类分子进行检测。并计算两种细胞混合培养后的吸光度值。 结果：体外诱导培养8 d后获得大量成熟的树突状细胞，细胞表面具有典型的树枝状突起，高表达树突状细胞相对特异性表面分子CD11c（78.46%）、 CD86(87.24%)及MHC-Ⅱ(92.65%)，同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖的能力。 结论：联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素体外诱导培养小鼠脾脏细胞，可生成大量功能成熟的树突状细胞。     

雌激素保护脑卒中后束缚应激大鼠作用与降钙素基因相关肽的相关性研究

目的:探讨雌激素保护脑卒中后束缚应激(PSR)大鼠作用与降钙素基因相关肽(CGRP)的相关性.方法:雌性SD 大鼠50只,经Open-Field实验评分后随机分成对照组、脑卒中组、束缚组、PSR组及雌激素治疗组,并建立相应模型.观察各组大鼠不同阶段行为学改变,并运用特异性放射免疫分析方法测定各组大鼠外周血,脊髓及前额叶的CGRP样免疫活性(CGRP-LI)物质,观察各组间CGRP-LI的改变.结果:与对照组比较,PSR大鼠Open-Field实验中水平和垂直得分明显减少,外周及中枢CGRP-LI含量明显降低;与PSR组比较,雌激素治疗组大鼠Open-Field实验中得分增加,外周血、脊髓及前额叶CGRP-LI含量较PSR组升高.结论:CGRP水平的上调可能是雌激素对PSR大鼠的保护作用之一.     

注射糖皮质激素和慢性束缚应激抑郁样大鼠模型的比较及其机制探讨

目的 比较束缚应激和注射糖皮质激素两种应激抑郁造模方法以及神经内分泌机制的探讨.方法 24只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组(NC组,8只), 束缚应激组(MS组,8只)和糖皮质激素组(CO组,8只),用长期束缚制动方法和注射氢化可的松建立大鼠应激抑郁模型,建模时间21天,每周进行体质量、1%蔗糖水消耗、旷场试验测定,造模结束后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠海马区糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor ,GR)mRNA表达的变化.结果 ① MS组和CO组大鼠体质量增加量,1%蔗糖水消耗量,行为学水平评分和垂直评分在第3周末均较NC组明显降低(F=26.36, 16.66, 18.72,13.36,P<0.01).②MS组和CO组在第2周和第3周各项行为学评分差异无统计学意义.③建模后MS组和CO组GRmRNA表达较NC组明显降低(F=30.126,P<0.01).结论 两种造模方法均能较好模拟了抑郁症的精神运动迟滞和快感缺失,是可靠的应激抑郁动物模型,而GRmRNA表达的变化是应激介导抑郁样反应的神经内分泌机制之一.     

钾通道阻滞剂对多发性硬化患者细胞因子分泌的影响

目的研究多发性硬化(multiple sclerosis,MS)患者髓鞘反应性CD4+T淋巴细胞分泌γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的水平,并探讨钾通道阻滞剂对其分泌的影响。方法采用酶联免疫斑点方法(ELISPOT)对12例急性期MS患者、12例缓解期MS患者(经INF--β1b治疗)和10名健康对照的CD4+T淋巴细胞在有无髓鞘抗原和钾通道阻滞剂作用下分泌细胞因子INF-γ和IL-4的变化进行比较。结果 MS急性期外周血CD4+T细胞以分泌IFN-γ为主;MS急性期及缓解期的CD4+T淋巴细胞经髓鞘碱性蛋白(MBP)刺激后分泌IFN-γ的水平较未加抗原组均增高(P<0.05),加入Kv1.3通道阻滞剂海葵毒素(Stichodactyla helianthustoxin,SHK)后,MS急性期和缓解期的MBP反应CD4+T淋巴细胞IFN-γ分泌明显减低(P<0.05),而对IL-4无明显影响。结论 Kv1.3钾通道阻滞剂SHK能减少MS患者MBP反应CD4+T细胞分泌IFN-γ,提示髓鞘反应性CD4+T细胞上Kv1.3通道有可能作为治疗MS的新靶点。     

A型钾通道Kv4.1在戊四唑致痫大鼠海马区的表达

目的通过检测A型钾通道Kv4.1在戊四唑(PTZ)致痫大鼠海马CA1、CA3及齿状回区的表达变化,探讨A型钾通道在癫痫发病机制中的作用。方法 SD大鼠40只,随机分为正常组、致痫后1 h、24 h、72 h组。腹腔注射PTZ制备大鼠癫痫模型,应用免疫组化及Western Blot技术检测Kv4.1在各时间段海马CA1、CA3及齿状回区的蛋白表达情况。结果致痫组大鼠海马区Kv4.1蛋白表达水平在致痫后1 h、24 h、72 h三个时间段均明显高于正常组(P<0.05);各致痫组之间Kv4.1蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。结论大鼠癫痫模型海马区A型钾通道Kv4.1蛋白表达增多,Kv4.1的表达上调可能在癫痫的发生中起作用。     

Differential Kv1.3, KCa3.1, and Kir2.1 expression in “classically” and “alternatively” activated microglia

Microglia are highly plastic cells that can assume different phenotypes in response to microenvironmental signals. Lipopolysaccharide (LPS) and interferon‐γ (IFN‐γ) promote differentiation into classically activated M1‐like microglia, which produce high levels of pro‐inflammatory cytokines and nitric oxide and are thought to contribute to neurological damage in ischemic stroke and Alzheimer's disease. IL‐4 in contrast induces a phenotype associated with anti‐inflammatory effects and tissue repair. We here investigated whether these microglia subsets vary in their K⁺ channel expression by differentiating neonatal mouse microglia into M(LPS) and M(IL‐4) microglia and studying their K⁺ channel expression by whole‐cell patch‐clamp, quantitative PCR and immunohistochemistry. We identified three major types of K⁺ channels based on their biophysical and pharmacological fingerprints: a use‐dependent, outwardly rectifying current sensitive to the K_V1.3 blockers PAP‐1 and ShK‐186, an inwardly rectifying Ba²⁺‐sensitive K_ir2.1 current, and a Ca²⁺‐activated, TRAM‐34‐sensitive K_Ca3.1 current. Both K_V1.3 and K_Ca3.1 blockers inhibited pro‐inflammatory cytokine production and iNOS and COX2 expression demonstrating that K_V1.3 and K_Ca3.1 play important roles in microglia activation. Following differentiation with LPS or a combination of LPS and IFN‐γ microglia exhibited high K_V1.3 current densities (～50 pA/pF at 40 mV) and virtually no K_Ca3.1 and K_ir currents, while microglia differentiated with IL‐4 exhibited large K_ir2.1 currents (～ 10 pA/pF at ?120 mV). K_Ca3.1 currents were generally low but moderately increased following stimulation with IFN‐γ or ATP (～10 pS/pF). This differential K⁺ channel expression pattern suggests that K_V1.3 and K_Ca3.1 inhibitors could be used to inhibit detrimental neuroinflammatory microglia functions. GLIA 2016;65:106–121     

Suppression of the rat microglia Kv1.3 current by src-family tyrosine kinases and oxygen/glucose deprivation

Microglia activate following numerous acute insults to the brain, including oxygen/glucose deprivation (OGD), and both protein tyrosine kinases (PTKs) and K+ channels have been implicated in their activation. We identified Kv1.3 (voltage-gated potassium channel) protein in cultured rat microglia and confirmed that the native current is biophysically and pharmacologically similar to Kv1. 3. To explore whether src-family PTKs regulate the microglial Kv current, we first heterologously expressed Kv1.3 in a microglia-like cell line derived from neonatal rat brain (MLS-9). The resulting large Kv1.3 current was eliminated by co-transfecting the constitutively active PTK, v-src, then rapidly restored by the PTK inhibitor, lavendustin A. Acute activation of endogenous src kinases by a peptide activator significantly reduced the current, an effect that was mimicked by OGD. Similarly, in primary cultures of rat microglia, the endogenous Kv1.3-like current was inhibited by activating endogenous src-family PTKs and by OGD. Biochemical analysis showed that OGD increased the tyrosine phosphorylation of native Kv1.3 protein, which was alleviated by PTK inhibitors or reactive oxygen species (ROS) scavengers. Conversely, the basal level of Kv1.3 phosphorylation was decreased by PTK inhibitors or scavengers of ROS. Together, our results point to a post-insertional downregulation of the microglial Kv1.3-like current by oxidative stress and tyrosine phosphorylation. This interaction may be facilitated by a multiprotein complex because, in cultured microglia, the endogenous Kv1.3 and src proteins both bind to the scaffolding protein, post-synaptic density protein 95 (PSD-95). By associating with, and phosphorylating Kv1.3, src is well positioned to regulate microglial responses to oxidative stress.     

低氧预处理中Kv1.4和Kv4.2对海马和皮质的保护作用及其机制的研究

目的观察低氧预处理中Kv1.4和Kv4.2对海马和皮质的保护作用及机制。方法将35只雄性Wister大鼠随机分成低氧预处理组、严重低氧组和空白组。采用低压氧舱造模,低氧预处理组先置于低压氧舱4000米,每天2 h,连续3 d后再置于7000米,3 h;严重低氧组置于低压氧舱7000米,3 h;空白组不给予低氧处理。造模成功后于0 h、3 h、24 h 3个时间点,分别取材海马和皮质,采用Q-PCR的方法分别检测各组Wister大鼠海马和皮质Kv1.4和Kv4.2的基因表达,采用统计软件进行数据分析。结果 (1)低氧预处理组、严重低氧组大鼠海马中KV1.4和Kv4.2、大鼠皮质中Kv4.2的mRNA表达,在3 h、24 h均较空白组高,大鼠皮质中Kv1.4的mRNA表达在24 h高于空白组,有显著性差异(P<0.01),说明低氧时出现脑损害。(2)低氧预处理组大鼠海马和皮质中Kv1.4和Kv4.2的mRNA表达,与严重低氧组比较有下降,尤其是24 h明显降低,有显著性差异(P<0.01),说明低氧预处理过程可抑制Kv1.4和Kv4.2的mRNA过度表达,具有脑保护作用。结论低氧预处理对脑的保护作用可能与抑制Kv1.4和Kv4.2的mRNA表达有关。