p16基因甲基化对肺癌早期诊断的临床研究

目的检测肺癌患者支气管灌洗液及全DNA中p16基因甲基化,并探讨其在肺癌早期诊断中的作用。方法利用半巢式甲基化特异性PCR技术,检测26例肺癌患者支气管灌洗液及相应全血中DNA p16基因的异常甲基化状态。结果34.6%(9/26)肺癌组织出现p16基因甲基化,出现甲基化组织对应的血液标本中88.9%(8/9)出现p16基因甲基化。支气管灌洗液中p16基因的甲基化状况与全血中是否出现p16基因甲基化关系密切(P<0.01)。结论肺癌患者支气管灌洗液及血液标本中p16基因甲基化的检测可能有助于肺癌的早期诊断。     

p16基因异常甲基化检测对周围型肺癌的诊断价值

目的:了解周围型肺癌患者外周血血浆中p16基因异常甲基化发生情况及其在周围型肺癌临床辅助诊断中的应用价值。方法:选取56例肺周围型结节手术患者的血浆和组织标本,其中31例为周围型肺癌,25例为肺部良性结节,采用甲基化特异性聚合酶链反应方法检测p16基因启动子的异常甲基化情况。结果:在周围型肺癌患者的血浆和肿瘤组织中,p16基因甲基化检出率分别为64.5%(20/31)和70.9%(22/31);周围型肺癌患者血清、肿瘤组织中p16基因的甲基化异常事件与肿瘤分期、分型无明显相关性。在25例良性肺部疾病患者中,3例血浆和手术切除标本检测出p16基因启动子的异常甲基化存在;良、恶性肺周围型结节的p16基因异常甲基化发生情况差异存在显著性。结论:检测周围型肺癌患者血浆中p16基因异常甲基化情况有可能成为有价值的临床辅助诊断手段。     

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的　介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法　将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果　在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论　筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

胃癌中p16蛋白表达和p16基因启动子甲基化的研究

目的:探讨胃癌中p16基因的失活机制。方法:采用免疫组织化学SP方法检测40例胃癌组织和43例正常胃黏膜组织中p16蛋白的表达情况,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法研究40例胃癌组织和35例正常胃黏膜组织p16基因启动子的甲基化状况。结果:23例胃癌组织的p16基因启动子发生了甲基化,甲基化发生率为58%,正常胃黏膜组织中未发现甲基化,两组间比较差异有显著性(P<0.01)。31例胃癌组织中的p16蛋白表达阴性,正常胃黏膜组织中6例表达阴性,两组间差异有显著性(P<0.01)。胃癌组织中,MSP方法和免疫组织化学方法结果间差异无显著性(P>0.05)。结论:胃癌的发生与p16基因失活关系密切,启动子甲基化可能抑制了蛋白的表达,这种途径可能是胃癌中p16基因失活的重要机制。     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的　改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法　用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果　单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论　半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。     

结直肠癌患者p16基因甲基化的检测

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性。方法选取2004年5月至2004年12月第三军医大学西南医院及贵州省人民医院普外科住院的结直肠癌患者53例,所有患者均经病理学诊断证实,并按Dukes病理分期分为四期,提取肿瘤组织DNA,分别应用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific polymerase chain reaction,nested-MSP)及甲基化特异性PCR(methylation specific polvmerase chain reaction,MSP)方法,检测患者肿瘤组织中p16基冈的异常甲基化情况;比较MSP及nested-MSP两方法的灵敏度。结果应用MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为23.8%和59.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05);应用nested-MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为52.4%和84.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05)。应用MSP与nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的阳性率分别为45.3%(24/53)、71.7%(38/53),两组比较有显著性差异(P<0.01)。结论应用nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的灵敏度明显高于普通的MSP方法,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为结直肠癌辅助诊断及预后评估的有效方法之一。     

肺癌患者癌组织和血浆p16基因甲基化的检测及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌患者癌组织和血浆p16基因甲基化及其临床意义。方法选择120例非小细胞肺癌患者,用巢式甲基化特异性聚合酶链反应法检测其肺癌组织、癌旁正常组织和外周血血浆p16基因的甲基化,并对120例正常对照组血浆样品进行p16基因甲基化检测,各组检测结果进行比较。结果肺癌组织p16基因甲基化率44.2%,高于癌旁组织的11.7%(P0.01);非小细胞肺癌患者血浆样品中p16基因甲基化检测率为32.5%,对照组血浆未检测到p16基因甲基化(P0.01);肺癌患者血浆样品与癌组织p16基因甲基化检出率比较差异无显著性(P0.05);患者血浆样品与癌旁组织p16基因甲基化检出率比较差异有显著性(P0.01)。结论肺癌患者癌组织和血浆样本p16基因甲基化的检测都为肺癌的早期筛查和诊断提供了有价值的参考信息。     

结直肠癌中p16基因的甲基化改变与蛋白表达的关系

目的 检测结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因启动子区异常甲基化改变及蛋白表达情况,探讨其与结直肠癌发生发展与临床的关系。方法 采用甲基化特异PCR(MSP)和免疫组织化学链霉素过氧化物酶(SP)方法,对32份结直肠癌标本p16基因甲基化改变及蛋白表达情况进行检测分析。结果 p16甲基化阳性率为40.6％;p16蛋白表达阳性率75.0％;在病理分期中,DukesC、D期患者肿瘤组织中p16甲基化发生率63.0％,p16蛋白表达发生率为69.0％;DukesA、B期患者p16甲基化发生率为25.0％,p16蛋白表达阳性率为81.0％;在组织分化程度中,低分化癌中的p16甲基化阳性率为100.0％,p16蛋白表达阳性率为20.0％;在高、中分化癌中,p16甲基化的阳性率为30.0％,p16蛋13表达阳性率为85.0％;淋巴结转移癌患者肿瘤组织中p16基因甲基化阳性率为63.0％,淋巴结未转移的阳性率为25.0％;在肿瘤部位中,直肠癌p16蛋白表达阳性率为65.0％,结肠癌的阳性率为100.0％。结论 p16甲基化的改变可能影响p16蛋白的表达;p16甲基化、蛋白表达与结直肠癌的发生发展密切相关,p16甲基化和蛋白表达是结直肠癌患者诊断及预后的候选标志物之一。     

血浆p16启动子异常甲基化在肝癌诊断中的应用价值

目的探讨p16启动子异常甲基化在肝癌分子诊断中的应用价值。方法用酚／氯仿抽提、乙醇沉淀法提取44例患者术后肝癌组织DNA。用血液微量DNA提取试剂提取术前外周血液中DNA。经重亚硫酸钠转换，将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，再经纯化，甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）后，检测p16启动子甲基化产物，并将其敏感度、特异度等指标与甲胎蛋白（AFP）进行比较。结果经甲基化特异性PCR发现70．5％（31／44）的肝癌组织DNA存在p16启动子异常甲基化，其中有29例血浆DNA中也同时检出p16启动子异常甲基化产物，检出率为90．5％（29／31）。13例癌组织和血浆DNA中均未检测到p16甲基化产物。p16甲基化特异性PCR检测肝癌的敏感度为66％，特异度为94％，符合率为80％，阳性预测值96％，阴性预测值83％；AFP检测的敏感度为59％，特异度为84％，符合率为79．2％，阳性预测值68．4％，阴性预测值75％。p16甲基化的上述指标略优于AFP。结论血浆p16启动子甲基化的检测可能作为一种潜在的独立的非侵入性的肝癌分子诊断标志。     

错配杂交化学发光法定量检测p16基因过甲基化

目的建立一种基于错配杂交化学发光检测p16基因启动子区过甲基化的定量分析方法。方法用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。设计合成1对不含CpG位点的引物,同时扩增甲基化或非甲基化目的DNA片段,用2条分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交及化学发光检测,通过探针杂交信号强度比确定样品DNA中甲基化的p16基因的比例。结果错配杂交化学发光法具有较好的精密度(CV=5·2%~6·4%)和灵敏度(2·5×10-4pmol),检测已知混合样品的p16基因甲基化率分别为0%、23%、52%、70%及93%,与实际结果一致。结论本研究建立的错配杂交化学发光法是一种检测快速、操作简便的p16基因甲基化的定量检测方法。     

非小细胞肺癌中p16基因甲基化的临床分析

目的：研究非小细胞肺癌中p16基因甲基化的表达,分析p16基因甲基化与临床、病理资料之间的相关性。方法对61例经手术切除且病理确诊的非小细胞肺癌在术中提取新鲜癌组织和癌旁组织样本冷冻保存,提取DNA后经重亚硫酸盐修饰,用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测癌和癌旁组织中p16基因甲基化状态。结合临床及病理资料对实验结果进行统计学分析。结果非小细胞肺癌和癌旁组织中出现p16基因甲基化的阳性率分别为11.48%（7/61）和1.64%（1/61）（P＞0.05）。不同的病理分型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移程度及吸烟指数间p16基因甲基化状态差异无统计学意义（P＞0.05）。结论非小细胞肺癌组织中存在p16基因甲基化。     

非小细胞肺癌p16基因甲基化及其临床诊断意义

目的 研究非小细胞肺癌癌组织p16基因甲基化及其临床诊断意义.方法 选择47例非小细胞肺癌患者,用MSP技术检测肺癌组织和癌旁正常组织p16基因甲基化.结果 肺癌组织p16基因甲基化率44.7%,高于癌旁组织的17.0%(P＜0.01);肺癌组织甲基化检出率与临床分期、临床病理分型和临床分类之间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 提示肺癌有关组织或样本的p16基因甲基化,可能成为各种临床类型的非小细胞肺癌早期诊断的一个有效指标.但特异性、灵敏性和可行性等有待进一步研究.     

胃癌组织P16和P53蛋白表达的研究

目的研究胃癌组织中P16和P53蛋白的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学方法,对57例胃癌组织和癌旁组织、38例正常胃组织中p16和p53基因表达产物进行检测,并结合临床进行讨论和分析。结果胃癌组织中P16蛋白的阳性率为21.1%（12/57）,明显低于癌旁组织59.6%（34/57）和正常胃组织89.5%（34/38,P〈0.05）;P53蛋白的阳性率为80.7%（46/57）,明显高于癌旁黏膜组织42.1%（24/57）和正常胃组织0%（0/38,P〈0.05）。P16和P53蛋白表达与胃癌组织学类型、浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关（P〈0.05）。结论胃癌组织P16和P53蛋白的异常表达与胃癌发生发展、淋巴结转移和预后可能有关。     

异硫氰酸苯己酯降低U266细胞株p16基因甲基化的研究

本研究探讨异硫氰酸苯己酯对p16基因高甲基化的多发性骨髓瘤U266细胞株是否有去甲基化的作用。用异硫氰酸苯己酯0、5、10μmoL／L孵育U266细胞株，提取DNA备用。用亚硫酸氢盐处理正常人基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增。设计1组特殊荧光标记探针以构建1种检测p16基因启动子区3个CpG位点甲基化改变的芯片，特殊荧光标记探针包括1对非甲基化探针和甲基化探针，检测相邻的3个CpG位点甲基化的程度。采用基因芯片的方法，将完全未甲基化的DNA和完全甲基化的DNA混合后制成标准曲线，将U266细胞株样本处理后点在芯片上与标准曲线进行比较后得出定量检测的结果。结果表明：芯片上探针的可重复性和精确性很好，0、5、10μmol／L异硫氰酸苯己酯处理后的U266细胞株p16基因的甲基化程度分别为78．2％、61．7％、54．8％。结论：异硫氰酸苯己酯可以降低U266细胞株p16基因甲基化的程度。     

白血病p16基因失活的研究

为探讨白血病p16基因失活的发生率及其与疾病预后的关系,对48例初发或复发的白血病进行了p16基因失活研究。首先应用多重聚合酶链反应(MPCR)方法扩增p16基因纯合子缺失,然后用限制性内切酶-PCR方法检测p16基因甲基化。研究结果表明,48例患者中有p16基因失活者10例(占20.4％),其中p16纯合子缺失者5例(2例伴有9p丢失),p16基因甲基化者5例。有p16基因失活者,病情进展迅速,治疗效果差,患者在短期内死亡。结论提示:p16基因失活在部分白血病的发生、发展中起重要作用;有p16基因失活者预后较差;p16基因失活的检测对于判断预后具有重要意义。     

Deletion of p16 and p15 genes In schistosomiasis-associated bladder cancer (SABC)

Alterations of p16 and p15 genes have been reported in cancer cell lines and in certain malignant neoplasm. These genes are designated as candidate tumor suppressor genes because they encode proteins that function as negative cell cycle regulators at G₁-S checkpoint. One hundred and sixty eight tumor tissue, 20 schistosomal tissue, and 50 normal tissue samples were examined. The status of p16 and p15 genes in these tissues was determined by the polymerase chain reaction and by sequencing the DNA fragments produced during PCR. In addition, the expression of p16 and p15 proteins was examined by Western blot analysis. p16 and p15 genes were detected in all normal and schistosomal tissues. Deletion of both p16 and p15 genes was observed in 72 and 36 bladder tumors, respectively. Twenty eight of the 72 cases that exhibited p16 deletions also displayed deletions of p15. Only eight cases showed loss of the p15 gene while retaining p16 gene, and p16 deletion with apparently intact p15 gene was identified in 44 cases. The present analysis also reveals that deletion in the two genes are associated with low-stage, low grade bladder cancer, schistosomiasis-associated bladder cancer (SABC) and squamous cell carcinoma type (SCC). No point mutations were identified in either gene. The expression of p16 and p15 proteins was undetectable in 75 and 38 bladder tumors, respectively, by Western blot analysis. Alteration of the p16 and p15 genes appears to be an early event in bladder cancer which occurs more frequently in SABC and SCC, and may play an important role in the development of schistosomal bladder cancer.