微管结构仿生人工骨对犬腔隙性松质骨缺损的修复

目的建立一种新型松质骨缺损动物模型，同时评价应用纤维增强微管结构仿生人工骨修复该骨缺损的性能。方法成年犬双侧股骨下段分别制备2处直径10mm、深20min腔隙性松质骨缺损，以正交结构（A）组、同心结构（B）组仿生人工骨修复，设立磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）（C）组、空白（D）组为对照，术后6、12、24周进行影像学、组织学、形态计量学观察骨缺损修复情况。结果未经治疗的骨缺损不能自行愈合；人工骨修复组6周新生骨开始长人，6、12、24周时A、B、C组的成骨面积比（％）分别为（4．09±0．96）、（6．78±1．27）、（3．10±0．83），（8．98±2．45）、（15．38±2．33）、（4．25±1．03），（19．86±4．57）、（38．25±6．79）、（4．97±0．90）；相应各组CPC残留面积比（％）为83．19±3．69、81．93±3．80、86．87±4．48，68．14±5．39、34．59±5．50、75．83±4．51，38．55±4．78、22．20±3．46、62．89±4．31；各组新生骨面积比（％）B〉A〉C（P〈0．01），CPC残留面积比（％）C〉A〉B（P〈0．01）。结论该骨缺损模型稳定、可靠；微管结构仿生人工骨在促进成骨、加快CPC降解速度上优于不具有微管结构的人工骨，同心结构具有最佳成骨和促CPC降解作用。     

骨髓基质细胞成骨作用研究进展

18 67年 ,德国病理学家Ｃｏｈｎｈｅｉｍ在研究伤口愈合过程时 ,提出骨髓中有骨髓基质细胞 (ＭａｒｒｏｗＳｔｏｍａｌＣｅｌｌ,ＭＳＣ)存在的观点。 1974年Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等[1] 发现 ,骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落。 1988年Ｍａｍｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ等[2 ] 首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织 ,经Ｘ线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构 ,证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。Ｂｅｎａｋｙａｈｕ等[3 ] 将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞 (Ｏ…     

骨髓基质细胞促进引导性骨再生的研究

目的观察骨髓基质细胞增强引导性骨再生（GBR）修复骨缺损的能力。方法30只兔造成双桡骨干15mm骨缺损，以硅胶管桥接骨断端，实验组在硅胶管内注射自体骨髓基质细胞（MSC）1ml；对照组注射等量生理盐水。在不同时间内作X线片、大体、组织学观察及生化捡测。结果实验组成骨活跃，10周骨缺损完全修复，对照组各时间点骨修复均较实验组差，10周时仍无1只兔骨性愈合。术后4周实验组钙及碱性磷酸酶含量明显高于对照组（P〈0．01），术后8及10周实验组骨缺损区新生骨骨痂密度与相邻尺骨密度比值亦明显高于对照组（P〈0．01）。结论自体骨髓基质细胞可明显增强GBR修复骨缺损的能力。     

辛伐他汀对骨髓基质细胞骨形成蛋白-2表达及碱性磷酸酶活性的影响

目的　研究辛伐他汀对原代培养的骨髓基质细胞骨形成蛋白 - 2 (BMP- 2 )表达及碱性磷酸酶活性的影响 ,探讨其刺激成骨的作用机制。　方法　体外培养成年小鼠骨髓基质细胞 ,以不同浓度 (0、0 .1、 0 .2、0 .5和 1 .0μmol/L )的辛伐他汀、基因重组人 BMP- 2 (1 0 0 ng/ml)作用 72小时碱性磷酸酶活性的酶学测定 ;免疫细胞化学染色 ,Western Blotting检测 BMP- 2表达的变化。　结果　辛伐他汀作用 72小时后 ,细胞中的 BMP- 2表达水平增高 ,随浓度增加 ,表达量增加 ,对照组少量表达 ;碱性磷酸酶活性显著增加 ,呈剂量依赖关系 ,辛伐他汀 0 .5和 1 .0 μmol/L与对照组间具有统计学意义 (P<0 .0 5)。　结论　辛伐他汀可促进骨髓基质细胞中 BMP- 2的高表达 ,细胞自分泌或旁分泌BMP- 2增多 ,碱性磷酸酶活性增高 ,有促进成骨的作用     

骨形成蛋白2基因修饰的骨髓基质细胞与纤维蛋白复合物修复兔关节软骨缺损

目的 研究骨形成蛋白2（bone mophogenetic protein2，BMP-2）重组腺病毒（adenovirus）转染骨髓基质细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）后，与纤维蛋白凝胶构成的复合物（Ad—BMP-2＋MSCs-纤维蛋白凝胶）对兔关节软骨缺损修复的影响。方法 ①AdBMP-2转染原代培养的MSCs，通过RT—PCR、细胞免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色等观察转染后3～9d的MSCs其BMP-2、Ⅱ型胶原及蛋白多糖转录、表达水平的变化。②转染后的MSCs种植于纤维蛋白凝胶，在体外培养1～9d，通过上述指标及透射电镜观察三维培养条件下其软骨基质的产生。③42只日本大耳白兔先制成直径4．5mm全层软骨缺损模型，随机分为3组（n=14）：A组为Ad—BMP-2＋MSCs-纤维蛋白凝胶修复组，B组为MSCs-纤维蛋白凝胶修复组，C组为空白对照组。术后4、8和12周取材行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学及12周关节软骨弹性常数检测。结果 ①Ad—BMP-2转基因MSCs的BMP-2、Ⅱ型胶原mRNART—PCR检测分别在3、5d呈阳性，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。②转基因MSCs三维培养物免疫组织化学和甲苯胺蓝染色呈阳性，电镜显示细胞生长良好，有基质合成。③A组各时间点大体、组织形态学和组织化学染色均显著优于B组和C组，12周时力学和组织学已接近正常关节软骨。结论 Ad—BMP-2能通过促进MSCs分泌BMP-2，诱导Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，在纤维蛋白三维支架中形成软骨基质，移植入兔关节软骨缺损区可修复直径4．5mm缺损，其修复组织成分接近正常软骨。     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。     

种植骨髓基质细胞的骨组织工程学研究

目的 观察骨髓基质细胞在多孔状的人工骨块上三维立体培养后的生长情况及其复合植入体内后的成骨能力。方法 利用组织工程学方法,将骨髓基质细胞种植于羟基磷灰石人工骨块上,立体培养２周,用扫描电镜观察细胞在体外的生长情况;将上述细胞人工骨复合体自体异位植入体内,取材观察其植入体内后的成骨情况。结果 细胞在人工骨块上能立体培养成活,细胞多生长于周边的孔隙表面,尤其以贴近培养瓶底的那一边较多,骨块的中心部位未     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。     

磷酸钙人工骨结合骨髓基质干细胞移植修复骨缺损的实验研究

目的制备磷酸钙人工骨(calcium phosphats artifieal bone, CPC)与骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)复合物，通过动物实验研究其对骨缺损的修复作用。方法分离、扩增兔的BMSCs，并以CPC为载体制备cPc／BMSCs复合物，植入兔桡骨15mm骨缺损处。于术后不同时间处死动物，通过X线摄片、组织学染色分析和放射性核素监测，观察新骨形成和材料降解情况。同时以单纯的CPC及空白对照组作为对照研究，评价CPC／BMSCs复合物对骨缺损的修复能力。结果CPC／BMSCs复合物可再生新骨组织并完好地修复桡骨缺损，且其修复能力明显优于单纯的CPC。结论以CPC为载体的自体骨髓细胞移植能有效的修复骨缺损。     

骨髓基质干细胞在骨形成蛋白诱导下异位成骨及应用于人造骨的实验研究

目的 研究经分离培养的骨髓基质干细胞（MSC）在骨形成蛋白（BMP）诱导下在体内外的异位成骨效应,为研制一种本身具有成骨能力的人造骨材料提供实验依据。方法 分离、培养Wistar大鼠MSC,体外实验将MSC＋BMP分别在培养板和弥散小室内培养,体内实验将MSC＋BMP与人工珊瑚骨（CHA）制成复合移植体,种植在大鼠背肌内,用形态学、组织化学和免疫组化方法观察其成骨效应。结果 MSC在体外（培养板和弥散小室）只形成软骨基质,在体内复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）形成骨质,其成骨效应比对照组A（CHA＋MSC）和对照组B（CHA）强。结论 复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）有可能被研制成本身具有成骨能力的人造骨材料。除BMP外,移植体植入的机体和局部还存在其它诱导成骨的因子,进一步探讨这些因子的作用,将对研制这种理想的人造骨材料具有重要意义。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

骨髓基质细胞诱导分化与聚乳酸吸附培养细胞的初步研究

目的:1.验证骨髓基质细胞体外培养条件下是否分化为成骨细胞;2.探索多孔聚乳酸作为组织工程载体吸附培养骨髓基质细胞的可行性。方法:取兔骨髓细胞经培养得到骨髓基质细胞,以地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油诱导细胞分化,以原位杂交检测骨桥素和骨连接素mRNA,Von Kossa钙染色检测矿化结节。以生物可降解材料-聚乳酸吸附培养骨髓基质细胞,扫描电镜和组织学苏木精一伊红染色观察细胞的生长情况,并对载体中培养第4-12天细胞计数。结果:骨髓基质细胞经诱导第2周表达骨桥素,第3周表达骨桥素、骨连接素和形成矿化结节。细胞可以进入多孔聚乳酸内部生长,12天细胞密度可达2.6×10~7/cm~3。结论:1.骨髓基质细胞含有成骨干细胞;2.多孔聚乳酸可以吸附骨髓基质细胞生长,因此可能作为骨组织工程材料。     

煅烧骨与诱导的MSCs复合的实验研究

目的：观察大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）与经胶原涂层处理的煅烧骨（CCB）复合行体外培养时贴附、增殖能力的变化,探讨构建组织工程骨体外培养的最适时间。方法：制备鼠尾胶原（I型胶原）,无菌条件下,将煅烧骨置于胶原液中,2h后取出骨块,置滤网中将孔内外的胶原溶液沥干。体外培养的大鼠MSCs经矿化液诱导向成骨细胞分化。将分化后的成骨细胞滴加到涂胶原的煅烧骨块上,同时以未涂胶原的煅烧骨块为对照组。3天,7天时取材,扫描电镜下观察实验组与对照组成骨细胞在煅烧骨表面的贴附数量及形态,用细胞计数法测定细胞在两组材料的生长曲线,组织化学方法检测成骨细胞的ALP活性。结果：扫描电镜发现实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组（P〈0．01）。细胞计数认为实验组细胞在材料上粘附数量多,增殖速度快。实验组ALP活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：胶原修饰的煅烧骨具有良好的组织相容性,能明显提高成骨细胞的贴附,并且促进成骨细胞活性维持,体外培养7～8天时,材料上的细胞数达到最大,应尽快植入体内。     

胶原蛋白膜包裹藻酸钙凝胶/骨髓基质细胞/BMP-2复合体修复兔桡骨缺损

[目的]探讨在外源性生长因子(BMP -2)作用下,使用胶原蛋白膜包裹经体外培养扩增的骨髓基质干细胞(BMSCs)与藻酸钙凝胶形成的复合物修复骨缺损的可行性.[方法]选用成年新西兰白兔36只.手术造成两侧桡骨标准缺损后,左侧植入复合体,右侧空白对照.取自体BMSCs,经体外分离培养扩增后,与BMP -2、藻酸钙凝胶及胶原蛋白膜形成复合体修复骨缺损,于2、4、8、12周时行大体、X线片、免疫组织化学观察.[结果]整个过程中可见实验组缺损区新生骨组织增殖明显、持续时间较长,且无过量的结缔组织生长;X线早期可见连续性骨痂通过缺损区,分布均匀;免疫组织化学可见多个成骨中心,骨小梁排列有序,成熟骨替代完全,BMP分布持续时间长,且在新骨组织中分布范围大.[结论]复合体能修复骨缺损,并且能够阻挡周围软组织进入缺损区,为新骨生长提供空间;同时作为BMP的载体,能减少外溢,提高其疗效.     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

不同荧光蛋白标记技术对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响

目的探讨不同荧光蛋白标记方法对兔骨髓基质干细胞体外增殖能力的影响。方法从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分别采用逆转录病毒和质粒转染两种方式进行增强型绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记,G418筛选培养3周后,测定细胞生长曲线和贴壁率的变化。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1、真核表达载体pDsRed2-C1均可以成功标记骨髓基质干细胞,G418筛选培养后,细胞表达明显的荧光蛋白,其阳性率增加。pLEGFP-N1标记组细胞倍增时间为(34.9±1.2)h,pDsRed2-C1组为(36.1±1.4)h,未标记组为(33.8±0.5)h,3组数据间无统计学差异(P>0.05)。结论荧光蛋白标记对骨髓基质干细胞体外增殖无明显影响,合理应用不同荧光蛋白及其表达载体将成为深入研究组织工程种子细胞的有力工具。     

骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究

[目的]探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-1单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。[结果]常规形态学观察，rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。[结论]rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

改良法体外诱导骨髓基质干细胞分化为类许旺细胞

目的　探讨一种较为有效的诱导方法将骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为类许旺细胞。　方法　用Dezawa所述方法 (称为传统诱导法 )加以改良成将所有诱导剂一起联合半量间隔诱导两次的方法 (称为改良诱导法 ) ,诱导后的细胞从形态学、抗S 10 0和抗GFAP细胞免疫化学染色的阳性率、MTT细胞活性测定及流式细胞仪检测细胞DNA含量来比较此两种方法对细胞的综合作用。　结果　改良法诱导的细胞在形态上更具有许旺细胞的长梭形外观 ,抗S 10 0及抗 GFAP阳性率分别由5 8 1%和 60 3 %提高到 79 4%、81 2 % (P <0 0 5 ) ;MTT法细胞活性测定表明改良法对细胞活性影响小(P <0 0 1) ;流式细胞仪DNA含量测定显示S期DNA含量较高 (P <0 0 5 )。　结论　改良法体外诱导骨髓基质干细胞为类许旺细胞具有诱导效果更好 ,对细胞损害小的优越性。     

大鼠组织提取液对体外培养骨髓基质细胞的影响

目的研究大鼠脑组织成份和其它组织提取液对体外培养骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC)的影响。方法提取大鼠全脑、灰质、白质、垂体、肌肉、肝脏等组织液,进行原代骨髓基质细胞培养,观察并测定其ALP染色阳性率。以空白培养液作对照,观察大鼠各组织提取液对骨髓基质细胞增殖,分化,矿化的作用。结果(1)各组织提取液对原代骨髓基质细胞培养后,其ALP染色阳性率以灰质和全脑组最高,其次是白质和肌肉组。(2)除肝脏组外其余各组织提取液对BMSC均有不同程度的增殖刺激作用,以灰质最强,其它依次为肌肉、白质、全脑与血清组,肝脏组则显示对BMSC增殖有抑制作用。(3)肝脏组对BMSC具有分化抑制作用,其它各组均显示分化刺激作用,增加程度依次为灰质、全脑、白质、肌肉与血清。(4)灰质组的矿化结节形成率最高,其它依次为全脑、白质、肌肉与血清。结论大鼠脑组织中的灰质提取液能显著刺激原代骨髓基质细胞增殖,且向成骨细胞诱导分化,并且在二代以后的BMSC培养中,表现出最强的刺激增殖、向成骨细胞分化和体外矿化的能力。