CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用

实验旨在研究CD4^＋CD25^＋T细胞在CD8^＋T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用。将小鼠脾脏中分离的单个核细胞分为两组．即去除CD4^＋CD25^＋T细胞组和未去除CD4^＋CD25^＋T细胞组,测定树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽刺激不同T细胞增殖活性、细胞因子IFN一1分泌,以及多肽特异性CD8^＋T细胞对同源性胃癌细胞株MFC的杀伤活性。结果显示预先去除未致敏T细胞中的CD4^＋CD25^＋T细胞,所诱导的特异性CD8^＋CTL对肿瘤细胞免疫应答增强,表现为反应性T细胞对树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽增殖反应增强,IFN-γ分泌量提高及CD8＋T细胞对MFC杀伤活性增强。这些结果表明。预先去除未致敏T细胞中的CD4^＋CD25^＋T细胞,肿瘤抗原多肽修饰的树突状细胞肿瘤疫苗效能可明显增加。CD4^＋CD25^＋T细胞在CD8^＋T细胞抗肿瘤免疫中起下调作用。     

CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定

目的：鉴定CTL识别的HLA—A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位。方法：以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC)，通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定。用表位预测法选取并合成两种肽分子，分别脉冲成熟的DC，并刺激HLA—A2^ 健康人自体CD8^ T细胞，1wk后，用脉冲肽的自体PBMC以每7d的间隔刺激该CD8^ T细胞3次。以共接受4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL，用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验，检测CTL对靶细胞的杀伤效应。用酶联免疫斑点法(ELISPOT)．检测CTL中抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞数。结果：形态学和流式细胞术的结果显示．PBMC可诱生成熟的DC。肽1235(FLPDHINIV)诱导的CTL．可特异性杀伤1235脉冲的T2细胞和OVA66^ 、HLA—A2^ 的SW480细胞，且L235诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞数增加。结论：卵巢癌相关抗原OVA66的HLA—A2限制性CTL表位1235．能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答，为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础。     

抗原特异性调节性T细胞的诱导及其对动脉粥样硬化的影响

目的探讨热休克蛋白（HSP）60抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞的体外诱导及其对动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法分离apoE^-/-小鼠骨髓单个核细胞，经阿司匹林处理培养出未成熟树突状细胞；体外诱导HSP60特异性调节性T细胞分化，检测其百分比和分泌功能；通过混合淋巴细胞反应研究CD4^＋CD25^＋T细胞的特异性抑制效应；过继转移CD4^＋CD25^＋T细胞后，观察其对小鼠动脉粥样斑块形成的影响。结果阿司匹林处理的树突状细胞共刺激分子CD80和CD86表达减少，形态学表现为未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞比成熟树突状细胞能诱导更多的特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，培养体系中IL-10和TGF-β1水平明显升高。CD4^＋CD25^＋T细胞体外明显抑制效应性T细胞的增殖以及IFN-γ的分泌。体内，过继转移HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞组小鼠动脉粥样斑块面积显著小于对照组。结论未成熟树突状细胞可诱导出HSP60抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体内能明显抑制动脉粥样斑块的形成。     

不同免疫状态乙型肝炎患者外周血毒性T淋巴细胞的变化

引起乙型肝炎患者相应的毒性T淋巴细胞（CD8^＋CD45RA^＋CD28^-CTL,CTL）反应低下或无能的原因很多,包括免疫忽视、T细胞无反应性、特异性T细胞耗竭以及树突状细胞功能障碍和T辅助细胞2反应偏离等。有许多学者对于慢性乙型肝炎的严重程度与特异性CTL之间的关系进行了分析研究,     

CD4+CD25+调节性T细胞的生物学特性及功能

对自身抗原产生免疫耐受是防止发生自身免疫病的关键。自1995年日本学者Sakaguchi等首次报道CD4^＋CD25^＋调节性T（Treg）细胞以来，越来越多的研究证明这群T细胞在自身耐受的维持中发挥着重要的作用。CD4^＋CD25^＋调节性T细胞具有以下特点：①自身免疫防御作用；②自然条件下是处于无能（Anergy）状态；③抑制其他CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的生物活性；④抑制活性是抗原非特异性的；⑤抑制方法可能通过细胞与细胞间直接接触，或经分泌抑制性细胞因子发挥免疫抑制效应；     

EBV-LMP2A重组腺病毒体外转染树突状细胞激发特异性CTL的研究

目的：用EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)重组腺病毒转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。方法：用AdS-LaMP2A重组腺病毒转染EBV健康携带者及鼻咽癌患者的DC，与自体来源的外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，激发LMP2A特异性CIL。用LDH释放法检测CIL杀伤活性；流式细胞术(FACS)检测培养细胞群体中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 、CD56^ 细胞的组成；生物活性法检测细胞培养上清中IFN-γ含量；RT-PCR分析CTL的FasL mRNA表达。结果：EBV健康携带者及鼻咽癌患者的PBMC，经AdS-LMP2A转染的自体DC两次刺激后，都能诱导出显著的EBV-LMP2A特异的CIL。EBV健康携带者CTL的杀伤活性，随DC刺激次数的增加而逐渐增强，诱导的CTL细胞群体以CD^4 和CD8^ 细胞组成为主，且CD4^ 细胞比例高于CD8^ 细胞，另含少量CD56^ 细胞；在不同时段所诱导的CTL上清中，均含一定量的IFN-γ并随刺激次数和诱导时间的延长呈上升趋势；RT-PCR研究表明，所诱导的CTL有FasL mRNA的表达。结论：以腺病毒载体介导EBV-LMP2A基因转染的成熟DC，在体外能激发较强的LMP2A特异的功能性CTL，可用于EBV相关NPC的免疫治疗。     

CD4^＋T细胞识别的肿瘤抗原的研究进展

在以往的肿瘤免疫研究中，人们往往关注肿瘤特异性CD8^ T细胞的抗肿瘤效应，并由此鉴定出许多CD8^ T细胞识别的肿瘤抗原。随着研究的深入，CD4^ T细胞在抗肿瘤免疫中的作用逐渐为人们所关注。联合应用MHCI类和MHCⅡ类限制性抗原的肿瘤疫苗将有可能取得更好的抗肿瘤效果。本文就近年来鉴定的CD4^ T细胞识别的肿瘤特异性抗原进行了综述。     

抗肿瘤免疫研究的体外检测指标

随着分子生物学及相关技术的发展，肿瘤的免疫治疗已成为当前令人关注的研究领域。在机体抗肿瘤免疫中，各种淋巴细胞都有可能发挥作用，但大量研究表明，T细胞扮演着最重要的角色，尤其是CD8^ 细胞毒性T细胞(CTLs^ )和CD4^ 辅助T细胞(Th)，前者可识别肿瘤细胞表面被MHC Ⅰ类分子递呈的抗原多肽，导致肿瘤细胞裂解；后者可使CTL前体细胞增殖，产生大量效应细胞。所以在肿瘤免疫治疗中，检测CD8^ CTL反应和Th1型CD4^ T细胞的数目和功能是评价疗效的关键。     

基因修饰树突状细胞诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群重排的研究

目的探讨以腺相关病毒（AAV）为载体,前列腺特异性抗原（PSA）基因转染树突状细胞（DC）诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群变化特点及临床意义。方法抽取30例前列腺癌患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,以rAAV/PSA感染DC前体细胞,采用系列细胞因子诱导DC前体细胞成熟。第6天收集成熟DC并与T细胞按比例混合培养,诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。分别于DC与T细胞混合培养前后应用流式细胞术分析外周血T细胞亚群及调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋FoxP3^＋Treg）的表达水平。结果 PSA基因转染DC刺激T淋巴细胞爆发增殖,与培养前比较,混合培养6d后CD8^＋、CD8^＋CD69^＋、CD8^＋CD28^＋T细胞的比例和CD8^＋/CD4^＋比值均明显增高,差异有统计学意义（P〈0.01）;而CD8＋CD28-T细胞和Treg细胞的比例均显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。CD4^＋T细胞比例较前略有升高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PSA基因转染DC能够有效地激活CD8＋抗原特异性CTL,下调免疫抑制性T细胞,提高患者的细胞免疫功能,为前列腺癌的免疫治疗提供新的有效策略。     

酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答试验条件的优化

目的：探讨酶联免疫斑点（ELISPOT）实验特异性及敏感性的因素，优化酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的实验条件。方法：HLA－A2阳性正常人的外周血单个核细胞在体外经流感病毒抗原肽诱导1周后，观察不同实验条件对酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的影响。结果：CTL诱导时，效应细胞先分离出CD8^＋T细胞组获得的Flu抗原特异的细胞频数要高于CTL诱导后再分离出CD8^＋T细胞组（P＜0．05），自体DC（树状细胞）作APC（抗原提呈细胞）比自体CD8^-PBMC作APC，CTL的诱导效率高且特异（P＜0．05）；使用细胞因子组合（IL－7＋IL－2＋IL－6）优于单纯使用IL－2。CTL行ELISPOT检测时，T2－2细胞较T2－1细胞具有更强抗原提呈功能，增加Flu抗原特异的CD8^＋T细胞频数（P＜0．05）。结论：优化了酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的试验条件，优化的方法在临床肿瘤疫苗的研究中具有应用价值。     

SARS-CoV S DNA疫苗诱导特异性T细胞及相关细胞因子的特性研究

目的 小鼠经皮下SARS-CoV S DNA疫苗免疫后，研究其特异性T细胞及相关细胞因子的特性。方法SARS-CoV S DNA疫苗免疫BALB／c小鼠后，获取淋巴细胞悬液。经S抗原多肽刺激后，采用ELISA检测细胞培养上清液中IFN-γ／的水平，利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ和IL-2的表达及其关系。结果 当S混合多肽刺激后，DNA疫苗免疫小鼠的淋巴细胞产生大量的IFN-γ，与对照鼠相比差异有统计学意义（P〈0．01）。细胞亚群分析的结果表明，IFN-γ^＋和IL-2^＋的CD4^＋T细胞百分率明显高于CD8^＋T细胞。单独产生IL-2的细胞占大多数，其次为IFN-γ和IL-2双阳性细胞，只产生IFN-γ的细胞很少。结论 SARS-CoV S DNA疫苗免疫小鼠后可以诱导抗原特异性CD4^＋和CD8^＋T细胞的产生。     

晚期肿瘤患者外周血CTL、Ts及NK细胞免疫表型的联检及临床意义

机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫效应机理是肿瘤免疫学研究中的重要内容。细胞免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。人类肿瘤特异性T细胞大多为CD8^＋T细胞,又可分为抑制性T细胞（Ts）和细胞毒性T细胞（CTL）,前者抑制体液和细胞免疫应答,调节维持内环境稳定,后者是直接杀伤肿瘤细胞的免疫效应细胞。NK细胞可溶解靶细胞如特异性肿瘤细胞株和受细胞内病原体感染的细胞,还可通过分泌炎性介质参与T细胞的分化,而控制T细胞反应。我们采用双色荧光标记流式细胞术分别检测了晚期肿瘤患者外周血CTL、Ts及NK细胞比例,从而评价晚期肿瘤患者的细胞免疫功能,对临床肿瘤治疗和预后判断具有重要的意义。     

细胞毒性T细胞在白血病中的研究进展

T细胞免疫在急性白血病的抗肿瘤免疫中起重要作用，细胞毒性T细胞(CTL)被活化至少需要两个信号，T辅助细胞的活化必须由抗原提呈细胞提呈MHC—Ⅱ类抗原，而后者还必须有表面的B7分子与T辅助细胞上的CD28分子相结合才能完成；急性白血病人体内可能存在可被IL—2诱导的CTL的前体细胞；CTL对白血病细胞的作用途径以MHC限制性途径为主。     

CD4^＋CD25^＋T调节细胞的研究进展

CD4^ CD25^ TR细胞通过抗原特异性方式或细胞接触的方式抑制自身反应性T细胞的活化，能有效地维持自身免疫耐受，是调节自身反应性T细胞和防止自身免疫病发生的重要调节细胞。     

抗原特异性调节性T细胞的诱导及其对粥样斑块形成的影响

目的：探讨抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞的体外诱导及其对动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法：从apoE^-/-小鼠骨髓提取并培养出未成熟树突状细胞，体外诱导热休克蛋白60特异性调节性T细胞；通过混合淋巴细胞反应研究CD4^＋CD25^＋T细胞的特异抑制性；过继转移CD4^＋CD25^＋T细胞后，观察小鼠动脉粥样斑块的形成状况。结果：阿司匹林处理的树突状细胞共刺激分子CD80和CD86表达减少；未成熟树突状细胞比成熟树突状细胞能诱导更多的特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体外能明显抑制效应性T细胞的增殖和IFN-γ的产生；过继HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞组小鼠斑块面积较小。结论：未成熟树突状细胞可诱导出抑制功能强大的HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体内能明显抑制斑块的形成。     

SP2/0细胞膜抗原负载DC诱导体外特异性CTL效应

目的 研究SP2／0细胞膜抗原负载树突状细胞（DC）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的杀伤活性。方法 密度梯度离心法分离SP2／0细胞膜，负载经rmGM-CSF和rmIL-4诱导扩增的小鼠骨髓来源的DC，活化T淋巴细胞获得肿瘤特异性CTL，MTT法检测对SP2／0细胞的杀伤效果。结果 骨髓单个核细胞在rmGM-CSF和rmIL-4作用下获得了高表达CDS0、CD86和MHC-Ⅱ分子的DC，致敏的CTL对SP2／0骨髓瘤细胞具有高杀伤率，显著高于对I5178Y淋巴瘤细胞的杀伤活性（P〈0．01）。结论 SP2／0细胞膜抗原负载DC能诱导明显的特异性抗肿瘤免疫应答。     

一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法

Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137为表面标记，从人 CD8＋T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137分子表达于活化的 CD4^＋和 CD8^＋T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后12 h ~5 d 内持续表达[3]。因此可以CD137为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。     

T细胞疫苗诱导异种特异性免疫耐受的作用探讨

目的：探讨T细胞疫苗诱导异种特异性免疫耐受的作用。方法：制备SD大鼠针对脉鼠的T细胞疫苗(TCV)，然后用T细胞疫苗免疫正常SD大鼠，连续3周，每周1次，同时设空白对照组。以被免疫SD大鼠的脾细胞作为反应细胞，以豚鼠的脾细胞作为刺激细胞(经丝裂霉素处理)，于接种前和每次接种后第5天进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)，同时对外周血T细胞凋亡和CD4^ 、CD8^ T细胞亚群进行检测。结果：MLR及结果显示，在TCV组，SD大鼠的脾细胞反应程度比接种前显著减弱(P＜0．01)，接种后相同时点组间比较，TCV组显著低于对照组(P＜0．01)；接种T细胞疫苗后，外周血T细胞凋亡率比接种前显著增加(P＜0．01)，并随着接种次数的增加而升高；随着接种T细胞疫苗次数的增加，CD/CD8逐渐减小，与MLR及的cpm值的递减趋势一致。结论：T细胞疫苗成功地诱导出异种特异性免疫耐受。T细胞疫苗可能通过诱导抗原特异性的反应性T细胞凋亡去除独特型T细胞克隆，进而诱导出抗原特异性免疫耐受；CD4/CD8与免疫耐受的产生有关，CD4/CD8降低有利于特异性免疫耐受的形成。     

人外周血卡介苗(BCG)特异性中央型和效应型记忆CD4+T细胞的特征

目的：探讨正常人外周血BCG特异性记忆T细胞的特征。方法：分离PPD^-和PPD^＋正常人PBMCs，与BCG进行培养，采用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN-γ的水平，ELISPOT法检测分泌IFN-γ的细胞数，利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测细胞表面分子及细胞内因子IFN-γ和IL-2的表达及其关系。结果：当BCG刺激后，PPD^＋正常人PBMCs不产生或只产生少量的IFN-γ，而PPD^＋者IFN-γ产生的量和细胞数均明显增加（P〈0．05）。流式细胞检测分析的结果表明，当BCG刺激后，主要是CD4^-而非CD8^＋T细胞表达IFN-γ和IL-2，两者相比具有显著差异。在CD4^＋T细胞中单独产生IFN-γ的细胞占大多数，其次为IFN-γ和IL-2双阳性细胞，只产生IL-2的细胞占少数。此外，85％～95％以上的CD4^＋IFN-γ^＋T细胞为CD45RO^＋，其中60％以上的细胞为CCR7^＋，其余的为CCR7^-。同样地，80％～95％左右的细胞为CD62L。。结论：BCG可以诱导抗原特异性记忆CD4^＋T细胞的产生，其中大多数为中央型记忆CD4^＋T细胞，少数为效应记忆CD4^＋T细胞，提示其在预防和控制结核分枝杆菌感染中发挥重要作用。     

四聚体技术检测人外周血巨细胞病毒抗原特异性OTL

为深入了解抗病毒免疫机制,探索人在健康状态及巨细胞病毒（CMV）急性感染时抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）数量的动态变化.以CMV抗原肽、HLA-A＊0201重链和轻链制备CMV四聚体;分离并检测12名健康被检者外周血单个核细胞（PBMC）中CMV抗原特异CTL数量;PBMC体外培养建立CTL细胞系,于末次刺激的不同时相进行四聚体染色,流式细胞仪（FACS）检测抗原特异CTL数量.结果发现9名被检者PBMC中均检出抗原特异CTL;细胞系中CMV特异性CTL数量急剧增多,细胞系与PBMC相比,差异有显著的统计学意义（P＜0.001）;研究结果提示,9名被检者感染过CMV,血液中存在少量免疫记忆性T细胞,当再次遭遇同一抗原后发生克隆扩增.