小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

目的　建立成年小鼠骨髓间充质干细胞 (MSC)的分离和培养方法。方法　应用体外细胞培养技术将成年小鼠骨髓间充质干细胞自股骨、胫骨中分离、纯化和培养 ,用形态学鉴定培养的MSC ,用台盼蓝染色法及在光镜下观察分离培养的细胞和摄像纪录。结果　经培养存活的骨髓间充质干细胞呈长梭形 ,似成纤维样细胞 ,长宽比约为 2～ 3:1。结论　该方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法     

人骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的建立人骨髓间充质干细胞体外分离、培养体系,并将其向成骨细胞定向诱导分化。方法采用梯度离心法从人骨髓血中提取骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cell,MSC),经体外培养扩增,观察其生物学特性。结果在体外培养条件下,骨髓MSC具有较强的增殖能力,并能被诱导向成骨细胞分化。结论建立了骨髓MSC体外分离、培养的体系,探讨了骨髓MSC的生物学特性,为进一步研究MSC作为骨组织工程的种子细胞打下了基础。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

碱性成纤维细胞生长因子及维生素C对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及维生素C（Vc）两种影响因子单独或联合应用对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外生长及增殖的影响。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,分别用特定浓度的bFGF及Vc两种影响因子单独或联合应用,绘制细胞生长曲线,用四唑盐比色法（MTT）法、流式细胞仪及免疫组化染色法观察细胞的增殖及生长情况。结果细胞生长曲线、MTT法、流式细胞仪结果均显示第3～5天各组BMSCs增殖能力达高峰,其中Vc＋bFGF组增殖能力最强（P〈0.05）。第7天,对照组及单独应用bFGF和Vc组细胞增殖力均有所下降,仅Vc＋bFGF组细胞仍保持较强的增殖能力（P〈0.05）。结论bFGF和Vc均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用,联合应用bFGF和Vc促增殖作用最强,可以作为体外扩增培养骨髓间充质干细胞的最佳培养条件。     

短端粒小鼠与正常小鼠间充质干细胞的分离培养比较

目的 建立从小鼠微粒骨中获取间充质干细胞(MSC)方法,并观察比较野生型小鼠(WT鼠)和端粒酶基因敲除小鼠(Terc-/-鼠)MSC生物学特性的差异.方法采用体外细胞培养技术,从小鼠自体微骨片中分离纯化WT鼠和Terc -/-鼠的同充质干细胞,通过培养和传代,研究其增殖及生长特征.结果 原代培养及传代培养显示,WT鼠自体骨间充质干细胞比Terc -/ -鼠具有活跃的增殖倍增能力.结论 从鼠的微骨片获取MSC的方法重复性好,细胞纯度和细胞数量优于以往从骨髓获取MSC的方法,Terc -/ -鼠MSC生长增殖能力明显弱于WT鼠,其机制的研究有待深入.     

兔骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的建立体外分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的最佳条件，观察其生物学活性及诱导分化，初步探索MSC在生物材料支架内的增殖情况。方法采用Percoll(比重1．073)或Ficoll(比重1．007g／ml)分离骨髓单个核细胞，以含10％的胎牛血清DMEM／F12作为培养体系，用体外贴壁培养的方法筛选MSC。用流式细胞仪测定其细胞周期，以MTT比色法测定细胞增殖活性并计算其倍增时间，检测MSC的细胞化学特征，体外观察MSC在特定的诱导体系下向成骨和脂肪细胞分化，并用电镜观察了MSC在生物材料支架内的生长情况。结果用此方法分离培养的MSC经9天左右的淘汰培养即可得到第一代的细胞。细胞化学染色碱性磷酸酶、苏丹黑B、过氧化物酶阴性，非特异性酯酶、糖原呈阳性。培养扩增的细胞形态呈梭状，具有较快的增殖能力，细胞倍增时间在19．4h。2～8代的细胞呈均质状，且具有较好的多向分化的能力。结论分离培养的兔骨髓间充质干细胞在体外具有多向细胞分化的能力，具有人骨髓间充质干细胞生物学特性。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化

目的观察兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养增殖的生长特征及体外诱导条件下的成骨能力情况.方法抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,经密度梯度离心分离出MSC,用塑料培养板贴壁培养进一步纯化MSC,并培养增殖.观察MSC的生长特征,测定其生长曲线及贴壁率.对第2代MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.结果MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,增殖能力强.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性明显提高,并且出现矿化结节.结论获得的兔骨髓MSC生长增殖旺盛,分离培养MSC是可行的,且MSC具成骨分化潜能.     

体外分离和扩增兔骨髓间质干细胞及其生物学特性研究

目的　探讨体外培养兔骨髓间质干细胞 (MSC)生物学及培养方法 ,为组织工程研究奠定实验基础。方法　选用新西兰大白兔 ,于胫骨近端或股骨抽取骨髓 ,分离 ,扩增骨髓干细胞 ,原代培养后 ,将细胞按 1∶1比例传代培养 ,并用传 1～ 5代细胞按 1× 10 4种植于 96孔板内 ,绘制生长曲线 ,贴壁率 ,并加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) ,测其促进MSC的增殖情况。结果　原代骨髓基质细胞生长状态良好 ,传代至第 5代仍保持干细胞形态特点 ,且生长曲线基本相同 ,bFGF可明显促进MSC的增殖 ,呈量效关系。结论　应用本实验方法 ,可无创获取兔MSC ,体外稳定扩增 ,生长速度快 ,表明兔MSC可作为骨 /软骨组织工程的种子细胞。     

视黄醇对人脐带间充质干细胞表皮生长因子、干细胞因子、集落刺激因子1和白血病抑制因子的影响

目的 研究视黄醇(维生素A)对人脐带间充质干细胞表达表皮生长因子(EGF)、干细胞因子(SCF)、集落刺激因子l(CSF1)和白血病抑制因子(LIF)的影响.方法 分离鉴定人脐带间充质干细胞,待细胞生长稳定后分为4组,分别用含12％FBS、12％ FBS+1 μmol/L视黄醇、15％血清替代品(KSR)和15％ KSR+1 μmol/L视黄醇的DMEM/F12培养液培养,3d后收集细胞及培养液上清,用RT-PCR和ELISA分析视黄醇对人脐带间充质干细胞生成细胞因子EGF、SCF、CSF1和LIF的影响.结果 分离所得细胞具备人脐带间充质干细胞免疫表型特征,细胞因子EGF、SCF和CSF1在mRNA和蛋白质水平均表达,而LIF只在mRNA水平表达;添加视黄醇(1μmol/L)后,SCF和CSF1在mRNA、蛋白质水平均显著增加(P＜0.05),而EGF和LIF变化不显著(P≥0.05).结论 视黄醇(l mol/L)可促进体外培养的人脐带间充质干细胞生成细胞因子SCF和CSF1.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用

 目的 探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)体外对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及干细胞因子(stem cell factor,SCF)表达的刺激作用。方法 采用MTT法检测APS刺激72 h后SD大鼠MSCs增殖情况;RT PCR检测增殖过程中不同细胞因子mRNA的表达;real time PCR定量检测SCF mRNA的表达;Western blot检测SCF蛋白的表达;ELISA法检测培养上清液中SCF的含量。结果 与空白对照组相比,1、2、3 mg/mL APS组均具有促进MSCs增殖的作用,以1 mg/mL促增殖作用最为明显(P<0.01)。与空白血清组相比,10% APS含药血清具有明显促增殖作用(P<0.05),且明显促进SCF mRNA表达及可溶性SCF蛋白的分泌(P<0.05)。1 mg/mL APS明显促进SCF mRNA和SCF蛋白表达(P<0.05)。结论 APS促进MSCs增殖,可能与其促进MSCs表达SCF mRNA及SCF蛋白有关。     

SCF/c-Kit反应轴调控ADSCs在糖尿病创面修复中的作用研究

探讨干细胞因子（SCF）/ 干细胞因子受体（c-Kit）信号调节脂肪间充质干细胞（ADSCs）增殖、迁移的作用机制,及其在糖尿病创面愈合中的作用。方法分离培养ADSCs。将其分为ADSCs 组、ADSCs+SCF（4 ng/ml,24 h）组和ADSCs+SCF+c-Kit siRNA（4 ng/ml,24 h）组;利用Western blot检测c-Kit、p-AKT、AKT蛋白的表达;采用CCK-8、细胞克隆形成检测增殖情况;采用Transwell法检测迁移情况。采用链脲佐菌素腹腔注射复制糖尿病小鼠模型,并复制背部直径为2cm 的全层皮肤缺损模型。将6 只糖尿病裸鼠随机分为实验组和对照组,对照组小鼠于创面周围以皮内注射方式注射1×106个未处理的ADSCs,实验组小鼠注射等量的经SCF（4 ng/ml）预处理24 h后的ADSCs。10 d后处死各组裸鼠,计算创面愈合率,苏木精- 伊红染色法检测真皮层与表皮层间的厚度,比较两组的差异。结果SCF 诱导c-Kit的表达呈时间、浓度依赖性（p <0.05）。SCF促进ADSCs的增殖、迁移,c-Kit siRNA抑制ADSCs的增殖、迁移（p <0.05）。SCF促进p-AKT的表达,c-Kit siRNA抑制c-Kit、p-AKT 的表达。实验组糖尿病裸鼠创面愈合率更高,真皮层与表皮层厚度大（p <0.05）。结论SCF/c-Kit 反应轴激活PI3K/AKT 信号通路,促进ADSCs 增殖、迁移。SCF 预处理能够促进糖尿病裸鼠创面愈合。     

人脐血基质细胞自发分泌多种造血生长因子的实验研究

目的探讨体外培养的人脐血基质细胞分泌血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)的能力.方法留取不同培养时相点的培养液上清,ELISA法检测上清中TPO、GM-CSF、SCF的浓度,并与骨髓基质细胞的培养上清液对照比较其特点.结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、GM-CSF和SCF等造血生长因子,二者造血生长因子的分泌随着培养时间的延长而逐渐下降,其中人脐血基质细胞分泌TPO和SCF的高峰期出现在第7天,而GM-CSF的分泌则无高峰期的出现;通过与骨髓基质细胞分泌三种造血生长因子量进行对比发现,人脐血基质细胞SCF和GM-CSF的分泌量低于骨髓基质细胞,而TPO的分泌高于同期培养的骨髓基质细胞.结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞一样具有分泌造血生长因子,支持调控造血的作用.     

脑缺血再灌注损伤后神经细胞增殖相关因子基因的表达

目的 观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞巢蛋白（Nestin）、干细胞因子（SCF）和神经细胞黏附分子（NcAM）基因的表达。方法 成年健康雌性SD大鼠36只,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为缺血1．5h再灌注2h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d组和假手术组,每组4只。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织Nestin、SCF和NCAM mRNA的表达。结果 假手术组皮质和纹状体区Nestin、SCF和NCAM mRNA均有微弱表达。脑缺血再灌注后Nestin mRNA表达增高,皮质除再灌注2h以外、纹状体除再灌注2、6h以外,其余各时间点均明显高于假手术组。SCFmRNA表达,皮质除再灌注2、6、12h以外,纹状体除再灌注2、6h以外,其余各时间点均明显高于假手术组。NCAM mRNA于再灌注2h后在皮质和纹状体区开始表达,分别于再灌注12h和1d达高峰,7d后逐渐减少,14d降至假手术组水平。结论 脑缺血再灌注后SCF mRNA表达可能具有促进神经千细胞增殖作用,NCAM表达可能参与了损伤后脑组织的修复过程。     

大鼠间充质干细胞对BALB/c小鼠体外淋巴细胞实验的影响

目的 研究大鼠间充质干细胞(MSC)对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖和CD4+CD25+调节性T细胞亚群的变化。方法 分离、扩增SD大鼠MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定。取第5代MSC与分离的小鼠淋巴细胞在刀豆蛋白(ConA)刺激下共培养5天 ,流式细胞仪测定细胞增殖,CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化。结果 当淋巴细胞: MSCs在1:10及1:50时均可抑制ConA刺激下可抑制小鼠淋巴细胞增殖,淋巴细胞: MSCs在1:10 时CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例明显升高。结论 大鼠MSC具有异种基因免疫抑制作用     

中波紫外线的对角朊细胞合成SCF的作用

目的：研究中波紫外线对培养的角朊细胞合成干细胞因子的调节作用,阐明中波紫外线通过对角朊细胞分泌干细胞因子的调节而对黑素细胞的间接调控作用。方法：培养人角朊细胞,以中波紫外线（302nm,100mJ/cm^2）进行照射,采用原位杂交法测定干细胞因子的mRNA表达水平,采用免疫组化法测定干细胞因子在细胞内的蛋白合成水平。结果：正常皮肤表皮基底层和棘层的角朊细胞可合成SCF;UVB照射后细胞内SCFmRNA表达量增加,但未见蛋白合成的增加。结论：实验结果提示SCF可能参与UVB照射引起的皮肤色素沉着,并减少UVB引起的黑素细胞的损伤及凋亡,维持皮肤内黑素细胞的数量稳定。     

肝细胞生长因子和低氧诱导因子1修饰间充质干细胞的应用研究进展

间充质干细胞（MSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,肝细胞生长因子（HGF）是一种多功能细胞生长因子,HGF修饰骨髓MSC可以抑制骨髓MSC凋亡,提高细胞存活率.此外,MSC对缺氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路,HIF-1修饰的MSC将改善干细胞移植时的缺点,降低凋亡、促进增殖,提高细胞黏附能力,促进血管生成.同时,MSC可以成为HGE和HIF-1理想的细胞表达载体,可能成为组织工程和细胞治疗等领域的研究热点.     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

细胞因子及其组合对脐血基质细胞集落形成作用的比较

目的 观察细胞因子SCF、IL—3、BFGF及其不同组合对脐带血基质细胞集落形成的作用。方法 应用体外脐带血基质细胞贴壁培养的方法，分别加入不同的细胞因子，进行培养3周时的基质细胞集落计数和培养4周时贴壁细胞的增殖状态观察。结果 SCF BFGF、SCF BFGF IL—3对脐带血基质细胞的增殖具有明显的促进作用。结论 体外加入某些细胞生长因子对脐带血基质细胞具有明显的扩增作用，提示运用脐带血作为新的基质细胞来源在体外细胞因子组合的作用下扩增后进行回输，有望成为促进造血损伤修复的新措施。     

细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)直接接触共培养诱导MSCs向血管内皮细胞分化的作用.方法 将MSCs和HUVECs按一定比例混合直接共培养,48 h后用ELISA检测其共培养细胞培养液(实验组)及MSCs与HUVECs各自单独培养48 h后再混合的培养液(对照组)中VEGF含量;5 d后用免疫荧光细胞化学法观察和分析诱导后MSCs的胎肝激酶-1 ( fetal liver kinase-1, Flk-1) 和血管性血友病因子( von Willebrand factor, vWF)的表达以及其Dil-ac-LDL吞噬能力;并用透射电镜观察MSCs超微结构改变.结果 VEGF在实验组中的含量显著高于对照组;直接接触共培养诱导MSCs表达Flk-1蛋白,且部分Flk-1阳性MSCs同时表达vWF蛋白;部分MSCs具有吞噬Dil-ac-LDL功能;电镜下见MSCs出现分化特征,核质比缩小,细胞器较为丰富,并可见细胞融合现象.结论 HUVECs可以通过细胞间直接接触诱导共培养的MSCs开始向内皮分化;其机制可能与细胞间直接接触促进细胞分泌VEGF以及细胞融合密切相关.