青石棉诱导呼吸道上皮BEAS-2B细胞表达白细胞介素-8的研究

目的研究青石棉纤维作用于呼吸道上皮BEAS-2B细胞后白细胞介素-8(IL-8)蛋白和基因的表达水平及酪氨酸激酶抑制剂PD98059对IL-8表达的影响。方法用定量聚合酶链反应法测定青石棉纤维诱导BEAS-2B细胞后的IL-8mRNA水平;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定BEAS-2B细胞培养上清液中IL-8蛋白水平。结果不同浓度青石棉刺激BEAS-2B细胞后,细胞培养上清液中IL-8释放量明显增加,同样BEAS-2B细胞中IL-8mRNA表达显著上升,使用酪氨酸激酶抑制剂PD98059可明显抑制IL-8的蛋白及mRNA表达水平。结论青石棉可诱导IL-8的高表达,而这种表达可为PD98059所抑制,提示IL-8的表达受丝裂原活化蛋白激酶信号通路中磷酸化ERK蛋白表达的控制。     

α照射致BEAS-2B 细胞损伤circRNA分子筛选及功能预测

目的 探讨α照射对BEAS-2B细胞circRNA表达的影响,筛选潜在标志分子。方法 利用α源照射装置对BEAS-2B细胞进行分次照射,每次照射剂量为0.1 Gy,每次照射后传代培养10代,累计照射4次,传代培养40代。选取累计照射2次并传代培养20代细胞2B-0.1Gy（2）-20和累计照射4次传代培养40代的细胞2B-0.1Gy（4）-40,利用基因芯片进行circRNA的检测,进而筛选标志分子;通过CircInteractome等在线工具进行circRNA分子的功能预测分析。结果 经α照射后,2B-0.1Gy（2）-20及2B-0.1Gy（4）-40分别获得差异表达circRNA 357个及451个;共同差异表达且趋势一致的 circRNA 6个。circRNA功能预测显示,与6个circRNA相互作用miRNA达195个,且这些miRNA主要参与脂肪酸生物合成、赖氨酸降解、脂肪酸代谢等KEGG通路;5个circRNA相互作用蛋白及2个母源基因与肺癌患者总生存期显著相关。进一步利用Metascape构建了共同差异表达circRNA母源基因及蛋白的相互作用网络图。结论 α照射可诱导BEAS-2B细胞circRNA的差异表达,筛选获得6个潜在circRNA标志物分子;生物信息学分析揭示,候选circRNA可能通过“miRNA海绵”、“RBP海绵”等参与α照射致BEAS-2B细胞的损伤及恶性转化。     

低剂量As2O3诱导BEAS-2B细胞的基因谱研究

目的研究低剂量三氧化二砷(As2O3)处理人支气管上皮细胞(BEAS-2B)后基因表达的变化,为砷的致癌机制提供依据。方法将研究对象分为实验组和对照组,实验组添加As2O3,使终浓度为0.1μg/L,对照组添加等体积氯化钠溶液,培养3个月后同时提取两组细胞的总RNA,逆转录成cDNA,用Cy5标记,与全基因体基因表达图谱OneArray芯片杂交。所得数据利用Rosetta ResolverSystem(Rosetta Biosoftware)计算和处理。结果 BEAS-2B细胞经As2O3处理后,1518个基因片段的表达有显著上调,其中与肿瘤通路相关的基因主要有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、v-ets母红血球病病毒癌基因同源物1(ETS1)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)等15个癌基因出现显著上调,并且7个肿瘤相关基因组中的基因显著上调。另有1409个基因片段的表达显著下调,其中与肿瘤通路相关的基因有凋亡因子(BCL2L11)和细胞色素C氧化酶亚基(COX5A),且有2个肿瘤相关基因组中的基因显著下调。结论部分癌基因的上调可能是As2O3诱导BEAS-2B细胞癌变的重要调控环节。     

煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2-Keap1/ARE通路的影响

[目的]研究煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA和Nrf2蛋白表达的影响,以期探讨对抗煤焦沥青致细胞氧化损伤的分子靶标和通路。[方法]GC-MS检测煤焦沥青烟提取物的主要成分;采用细胞急性毒性实验,根据文献以及以往的实验将煤焦沥青烟提取物分为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/L五个染毒组,以BEAS-2B细胞为染毒对象进行实验;MTT法检测染毒BEAS-2B细胞生长增殖情况;RT-PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表达量;Western blot测定Nrf2蛋白的表达量。[结果]煤焦沥青烟提取物主要成分中86.02%为多环芳烃类化合物;浓度为1.25 mg/L时促进BEAS-2B细胞增殖,2.5～10 mg/L抑制细胞增殖;染毒组Nrf2 mRNA及蛋白表达量低于对照组,而Keap1 mRNA表达量高于对照组,差别均有统计学意义（P〈0.05）;在1.25～5.00 mg/L浓度范围内,随着染毒浓度的增加,Nrf2 mRNA和蛋白表达呈递增趋势,而染毒浓度为10.00 mg/L时,Nrf2 mRNA和蛋白的表达量均有所减少（P〈0.05）;NQO1 mRNA在2.5～5.00 mg/L浓度范围内随染毒浓度的增加表达水平逐渐升高。[结论]煤焦沥青烟提取物刺激BEAS-2B细胞后,可能通过Nrf2-Keap1/ARE通路来调节细胞抗氧化应激能力。     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中心体及其调控蛋白的变化

目的 分析煤焦沥青烟提取物诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B恶变过程中细胞内中心体及其调控蛋白的变化,探讨中心体在煤焦沥青烟提取物致肺癌中的作用及机制.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,作为煤焦沥青烟提取物染毒组(煤焦沥青组),设溶剂对照组和正常对照组平行传代培养,用细胞爬片间接免疫荧光法检测中心体改变,用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测相关基因的mRNA表达;细胞爬片免疫组化半定量法检测相关蛋白表达.结果 煤焦沥青组第20代细胞中心体总异常率为6.56％±1.01％,明显高于正常对照组(3.40％±0.86％)和溶剂对照组(3.14％±0.59％),差异有统计学意义(P＜0.05).与正常对照组(4.34％±1.04％)和溶剂对照组(4.33％±1.20％)比较,煤焦沥青组第30代细胞中心体总异常比例(22.39％±9.5％)明显增大,差异有统计学意义(P＜0.05).煤焦沥青组第20、30代细胞的P53、P21基因和蛋白表达明显降低,Cyclin E基因和蛋白表达明显升高,与正常对照组相和溶剂对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶性转化过程中,中心体异常出现在细胞恶性改变前.中心体异常可能是通过P53/P2 1/CyclinE通路异常而引起.     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞端粒蛋白的变化

目的 通过检测端粒保卫蛋白复合体中端粒保卫蛋白1 (POT1)、端粒重复序列结合因子1(TRF1)和TRF2在煤焦沥青烟致永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)癌变细胞中的表达变化,探讨其在煤焦沥青烟致肺癌发生中的作用。方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变。结果 BEAS-2B恶性转化细胞POT1和TRF1基因mRNA表达水平（分别为：0.63-0.04,0.36-0.01）和蛋白表达水平(分别为：0.36±0.05,0.09±0.03)均下调,与正常对照组(mRNA：POT1：1.00±0.04,TRF1：1.01±0.16;蛋白：POT1:0.55±0.07,TRF1：0.27±0.07)和二甲亚砜溶剂对照组(mRNA:POT1:0.89±0.12,TRF1：0.90±0.08;蛋白：POT1:0.55±0.10,TRF1:0.26±0.04)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。BEAS-2B恶性转化细胞TRF2基因mRNA表达水平( 1.45±0.07)和蛋白表达水平(0.88±0.06)均上调,与正常对照组(mRNA:1.00±0.07,蛋白：0.48±0.06)和二甲亚砜溶剂对照组（mRNA:1.00±0.06,蛋白：0.50±0.06）相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 在煤焦沥青烟致支气管上皮细胞恶性演化过程中,POT1、TRF1和TRF2基因和蛋白表达水平发生变化。     

细胞周期蛋白D1在石英致人细胞恶性转化中的作用

目的探讨细胞周期蛋白D1在石英致人胚肺成纤维细胞(HELF)恶性转化过程中所起的作用。方法采用基因重组与基因导入的方法将表达正义和反义细胞周期蛋白D1 RNA的pXJ41-细胞周期蛋白D1导入石英恶性转化HELF细胞中。采用原位杂交和免疫组化的方法检测细胞中细胞周期蛋白D1基因表达情况,分析细胞周期蛋白D1导入前后细胞生长速度、倍增时间、细胞周期分布、软琼脂克隆形成能力的改变。结果石英诱导HELF细胞恶性转化过程中细胞周期蛋白D1基因过表达,反义细胞周期蛋白D1 RNA可抑制石英恶性转化细胞的生长增殖。与石英恶性转化细胞相比,反义pXJ41-细胞周期蛋白D1转染细胞培养至第8天时,生长速率下降58．69％,倍增时间从21．0h延长到31．4h,G1期细胞比例从45．1％增加到52．7％,S期细胞比例由40．3％下降到33．1％,克隆形成率显著下降,克隆明显变小。结论细胞周期蛋白D1的异常表达与石英恶性转化细胞有密切的关系,高水平表达的细胞周期蛋白D1对维持恶性转化细胞的恶性性状起重要的作用。     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中姊妹染色单体分离相关蛋白的改变

目的 通过检测姊妹染色体凝集和分离相关蛋白染色体结构维持蛋白(SMC)1、SMC3、分离酶(Separase)和保全素(Securin)在煤焦沥青致BEAS-2B癌变细胞中的变化,探讨其在煤焦沥青接触者肺癌发生中的作用.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关基因的mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变.以二甲亚砜(DMSO)溶剂组和未染毒的正常传代的BEAS-2B细胞为对照组.结果 与正常对照组和DMSO溶剂对照组比较,煤焦沥青烟提取物诱导转化细胞中,SMC1基因和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05);煤焦沥青烟诱导组SMC3和Separase的基因和蛋白表达水平明显升高(基因:SMC3:2.54±0.20、Separase:2.42±0.22,蛋白:SMC3:0.27±0.02、Separase:0.25±0.02),Securin的基因和蛋白表达水平明显降低(基因:0.30±0.04,蛋白:0.17±0.01),与其他两组(DMSO溶剂对照组:基因:SMC3:1.13±0.12、Separase:1.00±0.04、Securin:0.90±0.11,蛋白:SMC3:0.10±0.03、Separase:0.18±0.02、Securin:0.22±0.02;正常对照组:基因:SMC3:1.00±0.11、Separase:1.00±0.08、Securin:1.00±0.11,蛋白:SMC3:0.09±0.01、Separase:0.18±0.01、Securin:0.23±0.02)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青致支气管上皮细胞恶性转化过程中,姊妹染色单体凝集和分离相关蛋白SMC3和Separase升高,Securin表达水平降低,参与了细胞恶性转化过程.     

AP-1在锌离子诱导BEAS-2B细胞COX-2基因转录中作用

目的探讨外源性锌离子对人支气管上皮细胞环氧化酶2(COX-2)基因诱导表达及转录因子激活蛋白-1(AP-1)的转录活性调节作用。方法以人支气管上皮细胞株BEAS-2B作为体外模型,Real-time PCR方法检测锌离子对BEAS-2B细胞COX-2基因表达影响;染色质免疫沉淀(ChIP) 实验检测50.0 μmol/L锌离子温育8 h后c-Jun(AP-1亚单位)和COX-2启动子的结合;用野生型和AP-1结合位点突变的COX-2启动子报告质粒转染BEAS-2B细胞,50.0 μmol/L锌离子温育8 h,采用荧光素酶报告基因检测COX-2基因启动子转录活性。结果 50.0 μmol/L Zn²⁺组BEAS-2B细胞中COX-2的mRNA相对表达量为(1.23±0.16),是对照组表达量(0.16±0.02)的7.68倍,表达明显升高(P<0.5);AP-1可与COX-2的基因启动子结合,COX-2基因启动子区AP-1结合位点突变可使锌离子所致的COX-2高转录活性降低82%。结论 转录因子AP-1可调节外源性锌离子所致人支气管上皮细胞COX-2基因的转录表达。     

过钒酸钠对无EPO状态下BET-2细胞线粒体膜电位与细胞凋亡的影响

目的:观察酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphotases,PTP)抑制剂过钒酸钠(sodium Pervanadate,Per)对去除EPO状态下BET-2细胞存活、增殖、线粒体膜电位改变与细胞凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪等方法观察Per对EPO依赖的小鼠源性髓系白血病细胞株BET-2细胞在无EPO状态下细胞存活、增殖、细胞线粒体膜电位改变、细胞凋亡的影响。结果:BET-2细胞对EPO有良好的依赖性,在无EPO状态下BET-2细胞增殖停滞、细胞线粒体膜电位下降,并出现细胞凋亡;适当浓度Per(1~31.25μmol/L)能促进无EPO状态下BET-2细胞存活、增殖,维持细胞线粒体膜电位,减少细胞凋亡。结论:通过Per等调控PTP活性可能促进EPO依赖的BET-2细胞在EPO缺乏状态下的存活、增殖。     

Nrf2调控细胞凋亡在砷致HBE细胞恶性转化过程中的作用

目的:观察亚砷酸钠（NaAsO 2）长期作用于永生化人支气管上皮细胞（HBE细胞）致其恶性转化过程中,核因子-E2相关因子2（Nrf2）对细胞凋亡的调控作用。 方法:用含0.0和1.0 μmol/L NaAsO 2的培养基培养HBE细胞,分别为对照组和染砷组。用含1.0 μmol/L ...     

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究

目的 建立煤焦沥青烟提取物诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B株的恶化模型;观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系.方法用四唑蓝(MTT)法测定煤焦沥青烟提取物的细胞毒性,以煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变;软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化能力,流式细胞术检测细...     

大气PM_(2.5)有机提取物暴露对BEAS-2B细胞因子表达的影响

目的通过观察人支气管上皮细胞(BEAS-2B)株释放IL-8I、L-1β、SICAM-1等的变化,探讨PM2.5有机提取物(EOM)对气道上皮细胞的炎性损伤作用;并研究BEAS-2B损伤后释放的炎症因子诱导T淋巴细胞表达CD25,从而可能参与类似于过敏性哮喘的变态反应过程。方法BEAS-2B暴露于3.75、7.5、15μg/mlPM2.5有机提取物,双抗夹心ELISA法检测培养上清液中IL-8I、L-1β、SICAM-1的变化;将BEAS-2B细胞损伤后释放的炎症因子作用于人外周血淋巴细胞,流式细胞仪检测淋巴细胞CD25阳性表达率。结果阴性对照组有少量IL-8I、L-1β、SICAM-1表达,且随着时间延长略有增加;与阴性对照组相比,随着PM2.5有机提取物染毒剂量的增加和作用时间的延长,IL-8I、L-1β、SICAM-1的表达也增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论BEAS-2B细胞暴露于PM2.5有机提取物后,释放与气道炎症反应及气道高变应性相关的IL-8I、L-1β、SICAM-1等炎性因子;BEAS-2B细胞损伤后释放的IL-1β等炎性因子能够促进T淋巴细胞表达CD25分子,从而可能参与类似于过敏性哮喘的变态反应过程。     

细胞周期蛋白依赖激酶K4在石英致人细胞恶性转化中的作用

目的 探讨细胞周期蛋白依赖激酶K4(CDK4)在石英致人胚肺成纤维细胞(2BS)恶性转化过程中所起的作用,为石英致癌机制提供理论依据。方法 用基因重组和基因导入的方法将表达反义CDK4 RNA的pXJ41-CDK4导入石英恶性转化的2BS细胞中。采用原位杂交和免疫组化方法检测细胞中CDK4基因表达情况,分析反义CDK4 RNA导入前后,细胞生长速度、倍增时间、细胞周期分布、软琼脂克隆形成能力的改变。结果 石英诱导2BS细胞恶性转化过程中CDK4基因过表达,CDK4基因mRNA表达水平的平均灰度值由26.58±4.78增加到303.47±72.39,蛋白表达水平平均灰度值由28.37±6.09增加到255.82±28.33;反义CDK4 RNA可抑制石英恶性转化细胞的生长增殖,CDK4基因mRNA表达从303.47±72.39降至43.73 4±10.12,蛋白表达从255.82±28.33降至41.92±3.25。与石英恶性转化细胞相比,反义pXJ41-CDK4转染细胞培养至第8天时,生长速率下降77.43％;倍增时间从21.0 h延长到42.7 h;G1期细胞比例从45.1％增加到58.0％,S期由40.3％下降到30.0％;克隆形成率明显下降,且克隆明显变小。结论 CDK4的异常表达与石英恶性转化细胞有密切的关系,高水平表达的CDK4对维持恶性转化细胞的恶性性状起重要的作用。     

活性氧、丙二醛及超氧化物歧化酶在NaAsO_2致人角质形成细胞恶性转化过程中的动态变化

目的探讨氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)在砷致人角质形成细胞(human keratinocytes,Ha Ca T)恶性转化不同阶段的动态变化。方法以含1.0μmol/L Na As O2的DMEM高糖完全培养基连续培养Ha Ca T细胞35代后,用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平变化、细胞生长动力学改变和软琼脂集落形成实验鉴定其是否发生恶性转化。分别收集0、1、7、14、21、28和35代细胞,采用流式细胞仪检测不同代数细胞内ROS活性,生化法检测细胞内MDA含量及SOD活性变化。结果 1.0μmol/L Na As O2处理Ha Ca T细胞28代开始MMP-9相对蛋白水平明显上升,35代后细胞生长速度明显增快,倍增时间明显缩短;软琼脂集落形成数为(107±11)个,较对照组(24±7)明显增多(P<0.01)。ROS水平在染毒0到14代间呈先上升后下降随后再上升趋势,14代以后ROS水平逐渐降低。MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势。SOD活性在染毒0到21代呈先上升后缓慢下降趋势,21代以后其活性再次升高,呈持续上升趋势,且较0代明显升高(P<0.05)。结论低剂量亚砷酸钠长期诱导Ha Ca T细胞发生恶性转化过程中伴随细胞内氧化-抗氧化平衡失调,染毒后期SOD活性持续增加而ROS水平持续降低。     

镍化合物致人胚肺细胞转化及细胞周期的研究

目的 探讨镍化合物与职业性肺癌的关系。方法 用水不溶性氧化镍和二硫化三镍体外转化人胚肺细胞（ＭＲＣ－９和ＩＭＲ－９０）,并用流式细胞术分析这些转化细胞的细胞周期改变。结果 细胞在染毒３～５个月后,ＭＲＣ－９和ＩＭＲ－９０细胞均被诱发形态转化,包括转化灶的形成、无序重叠交叉生长和类上皮细胞化等。并且有的转化细胞能在软琼脂培养基中生长并形成集落。流式细胞术分析发现,转化细胞细胞周期发生改变。如未处理的     

重组人粒细胞集落刺激因子对辐射诱发细胞恶性转化的影响

目的研究重组人粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor,G-CSF)对60Coγ射线诱发Wistar大鼠肺成纤维细胞恶性转化过程的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法、软琼脂克隆培养、流式细胞术(FCM)同时观察正常Wistar大鼠肺细胞、60Coγ射线照射细胞、经G-CSF预处理后60Coγ射线照射细胞、60Coγ射线照射后G-CSF持续处理细胞的增殖活性,克隆形成率和细胞周期的变化。结果G-CSF有抑制单纯照射细胞增殖的作用,使软琼脂克隆形成延迟,使进入细胞周期的细胞减少,细胞周期进程减慢。结论G-CSF能减缓细胞的恶性转化过程。     

烹调油烟冷凝物对细胞的氧化损伤研究

目的 通过测定细胞内和细胞上清液中活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。以及细胞膜上ATP酶的含量，对烹调油烟冷凝物(COFC)诱发永生化人支气管上皮细(BEAS-2B)产生ROS及其对细胞膜损伤进行研究。方法 采用分光光度法检测细胞外活性氧，荧光标记细胞内活性氧及ATP酶。结果 在烹调油烟染毒的细胞内ROS的产生与ATP酶的活性降低有关。结论 CA3F引起细胞膜损伤时，ROS的大量产生可能是ATP酶活性降低的主要因素，Ca^2 -ATP酶及Mg^2 -ATP酶对ROS敏感性强。     

柴油机排出颗粒物不同分离组分对SHE细胞恶性转化作用的研究

应用ＳＨＥ细胞对柴油机排出颗粒物不分离组分进行细胞毒性的转化试验，结果表明，各种组分具有明显的诱导ＳＨＥ细胞恶性转化的能力，并在一定范围内存在剂量－反应关系，不同分离组分其细胞毒辣性有所差别。