局灶性脑梗死大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达空间分布特征及时间演变规律

目的观察大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达的时间和空间分布的动态演变.方法实验于2004-03/06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成.选择Wistar大鼠84只,随机分为正常组6只、假手术组6只、局灶性脑梗死组72只,局灶性脑梗死组根据光照后时间分为30 min,3,6,9,12,24,36,48 h,3,4,5,6 d共12组,每组6只.采用光化学方法制作大鼠局灶性脑梗死模型.动物处死前1 h注射10 g/L伊文思兰1 mL.正常组不作任何处理,假手术组仅暴露完整的颅骨,按要求时间点麻醉处死大鼠取脑组织,观测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达采用免疫组织化学分析.结果参加实验的84只大鼠全部进入结果分析.①脑梗死后30 min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9阳性细胞出现,呈半球状向四周放射样扩展,随脑梗死时间的延长逐渐增多,二者均在48 h表达至高峰,但前者表达更显著(P＜0.05),阳性细胞局限于脑梗死区周围.②正常对照组、假手术组均未发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的阳性表达.结论①局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达部位一致,以坏死区为中心呈放射状空间分布特征.②二者均在30 min开始表达,48 h时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3较半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9表达增多,这种时间变化规律说明细胞凋亡的级联反应最终通路有放大作用.     

大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达及白花丹参叶的干预效应

目的：观察大鼠局灶性脑梗死后促进细胞凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化规律及白花丹参叶的保护作用方法：实验于2004—03／06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成。取50只Wistar大鼠，随机分为局灶性脑梗死组和白花丹参叶预处理组两组符25只，每组义按光照后时间分为30min．12，24，48，72h等5个亚组，每亚组5只。造模前，白花丹参叶预处理组大鼠给予20g／kg白花丹参叶水提物灌服，1次／d，连续7d，然后两组同时采用光化学法制作大鼠局灶性脑梗死的模型。利用免疫组化染色技术观察局灶性脑梗死后不同时间点大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化，并观察大鼠一般情况。结果：50只大鼠全部进入结果分析。①局灶性脑梗死组大鼠梗死后30min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，9阳性细胞出现，呈半球状向四周放射样扩展，随梗死时间的延长逐渐增多，二者行均在48h表达至高峰，但半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达更显著（P〈0．05），阳性细胞局限于梗死区周围。②预防性应用白花丹叶水提物后，大鼠出现明显的嗜睡现象，受损皮质表面积红染区、蓝染区明显减小，各时点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的阳性反应均明显减少，较单钝梗死组有显性差异（P〈0．05）。结论：局灶性脑梗死后可诱导仁胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达，白花丹参对脑梗死具有保护作用，其分子机制可能为抑制了半胱氨酸天冬氧酸蛋白酶3,9的表达。     

大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达及白花丹参叶的干预效应

目的:观察大鼠局灶性脑梗死后促进细胞凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化规律及白花丹参叶的保护作用。方法:实验于2004-03/06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成。取50只Wistar大鼠,随机分为局灶性脑梗死组和白花丹参叶预处理组两组各25只,每组又按光照后时间分为30min,12,24,48,72h等5个亚组,每亚组5只。造模前,白花丹参叶预处理组大鼠给予20g/kg白花丹参叶水提物灌服,1次/d,连续7d,然后两组同时采用光化学法制作大鼠局灶性脑梗死的模型。利用免疫组化染色技术观察局灶性脑梗死后不同时间点大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化,并观察大鼠一般情况。结果:50只大鼠全部进入结果分析。①局灶性脑梗死组大鼠梗死后30min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9阳性细胞出现,呈半球状向四周放射样扩展,随梗死时间的延长逐渐增多,二者均在48h表达至高峰,但半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达更显著(P<0.05)。阳性细胞局限于梗死区周围。②预防性应用白花丹参叶水提物后,大鼠出现明显的嗜睡现象,受损皮质表面积红染区、蓝染区明显减小。各时点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的阳性反应均明显减少,较单纯梗死组有显著性差异(P<0.05)。结论:局灶性脑梗死后可诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达,白花丹参对脑梗死具有保护作用,其分子机制可能为抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达。     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的：观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变，并探讨三者之间的时效关系。方法：实验于2004-04／10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只，随机分为假致伤组8只和损伤组40只，损伤组根据处死时间分为2，12，24，48，72h共5个时相点，每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型，假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤，术后24h处死。观察中度脑损伤后2h-3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术；观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果：48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况：创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞，并呈逐渐增多趋势，主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域，12-24h凋亡细胞增多，48-72h达到凋亡高峰，明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞，脑损伤后24-48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化：脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，伤后48h达高峰，损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，24h达高峰，而后开始下降。结论：大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的:观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变,并探讨三者之间的时效关系。方法:实验于2004-04/10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只,随机分为假致伤组8只和损伤组40只,损伤组根据处死时间分为2,12,24,48,72h共5个时相点,每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型,假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤,术后24h处死。观察中度脑损伤后2h～3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术;观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果:48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况:创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞,并呈逐渐增多趋势,主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域,12～24h凋亡细胞增多,48～72h达到凋亡高峰,明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达:脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞,脑损伤后24～48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化:脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,伤后48h达高峰,损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,24h达高峰,而后开始下降。结论:大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。     

海马局部脑组织血流量和神经元特征性变化与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8介导癫痫大鼠的关系

目的：检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8在癫痫大鼠海马神经元的表达及其与癫痫发作大鼠局部脑血流量和神经元变化的关系。方法：实验于2002—05／2003-10在复旦大学神经病研究所完成。选择清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为①正常对照组6只：杏仁核注射磷酸盐缓冲液。②空白对照组6只：磷酸盐缓冲液(脑室) 磷酸盐缓冲液(杏仁核内)。③单纯癫痫组36只：杏仁核内注射红藻氨酸诱发癫痫发作，发作1h后经股静脉注射安定(30mg／kg)终止发作，根据处死大鼠的时间点分0，2，4，8，24，72h6组，每组6只大鼠。⑧试验给药组6只：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk(脑室，0．3μg于红藻氨酸注射前20min，5min及红藻氨酸注射后1h分3次给药) 红藻氨酸(杏仁核内)。⑤实验对照组6只：磷酸盐缓冲液(脑室) 红藻氨酸(杏仁核内)；均于安定注射终止发作后24h处死大鼠。结果评估：①激光多普勒血流测定仪记录局部脑血流。②用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色和cresvl violet染色观察海马神经元凋亡和存活的变化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z—IETD—fmk对海马CA3区的脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞和存活细胞的影响。③用免疫荧光和蛋白印迹检测海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的表达。结果：造模过程中有2只大鼠死亡，补充2只，进入结果分析大鼠保持为60只。①红藻氨酸注射后10～20min内脑灌注率显示轻微升高趋势，随后于20～60min内逐渐下降，60min后脑灌注率基本保持稳定，发作前后脑灌注率无明显变化。②发作终止即刻半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8出现裂解片断，8h时出现脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞，24h时达高峰，存活神经元减少。脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk可减少脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞，增加存活神经元。③用免疫荧光和蛋白印迹检测结果：发作后在红藻氨酸注射同侧海马的CA3区神经元半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8免疫反应性增强。结论：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的激活参与了癫痫发作诱导海马CA3区神经元的损伤，且与局部脑血流量变化无关.     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义 继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子，脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡。目的：观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化，探讨其与神经细胞凋亡发生的关系，为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据。设计：自身对照、相互对照动物实验。单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科。材料：实验于2001-09／12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。54只SD大鼠，雌雄不限，体质量220～250g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。方法：①动物模型建立及分组：将大鼠分为对照组和损伤组，对照组仅做T8，T9椎板切除术，损伤组于4、8h和1，2，3，7，14和21d取材共9组，每组6只。以30g／L戊巴比妥钠腹腔麻醉后，按Nystrom法暴露T8，T9节段胸髓，将50g重物通过2．2mm&;#215;5．0mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5min，损伤后每天10：00，16：00和22：003次人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空。②取材及切片准备：在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长，将每组4只损伤段脊髓组织块，长约8mm，石蜡包埋，连续切片，分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）标记；每组2只在冰上处死，将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用。③检测指标：以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达，以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA的表达变化，以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平，并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性。主要观察指标：①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察。②免疫组化结果。③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化。④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性。结果：纳人结果分析的各组动物数均为6只。①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果：损伤段1h有广泛出血；4～8h脊髓结构开始破坏，大量的神经元死亡；24h脊髓破坏严重；7-21d损伤范围确定，脊髓内有空洞形成。②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达（2．1&;#177;0．5）；脊髓损伤后8h，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加（89．2&;#177;10．5），3d达到高峰（189．6&;#177;12．7）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似，呈正相关（r=0．941）。⑧逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA4h开始增高（0．442&;#177;0．024），48h达到高峰（0．634&;#177;0．028），7d后恢复正常（0．351&;#177;0．013），早于凋亡出现的时期，与神经细胞凋亡水平呈正相关（r=0．622）。④TUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：对照组及4h组仅见偶染细胞，8h后开始出现阳性细胞，主要位于灰质中；此后阳性细胞逐渐增多，3d达到高峰，7d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少，主要在周围白质中，14和21d可见少量的阳性细胞。结论：在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在；大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强，8h开始大量表达，24-48h达到高峰，与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠，从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看，与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致，可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节。从本实验可以看出，从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗，应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48h内应用。     

电针对急性脊髓损伤后Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察电针治疗对大鼠脊髓损伤后神经细胞再生修复过程中Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响．并与甲基强的松龙进行阳性对照。 方法：实验于2003-04／2004-06在佳木斯医学院中心实验室进行。①将健康成年Wistar大鼠64只单纯随机分为模型组、电针组、甲基强的松龙组及假手术组4组（n=16），除假手术组外。其他3组大鼠采用改良的Allen’s捶击法（50g&;#183;cm）制成大鼠T10脊髓损伤模型，假手术组仅切除椎板。不损伤脊髓。②电针组在损伤后即刻取督脉上的大椎和命门两穴进行治疗，电针频率2Hz,疏密波形,强度2．5mA，以针刺处肌肉轻微抖动为宜，持续30min。甲基强的松龙组在损伤后即刻尾静脉内注射30mg／kg甲基强的松龙。模型组和假手术组不做治疗。③各组分别于术后6,24h各处死8只。应用免疫组织化学方法及图像定量分析法观察各组脊髓损伤早期Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。 结果：经补充后61只大鼠进入结果分析。①脊髓损伤后6h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组（P〈0．05）。灰度值高于假手术和模型组相（P〈0．05,0．01）。②脊髓损伤后24h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组和模型组（P〈0．05），灰度值高于假手术和模型组（P〈0．05，0．01）；但电针与甲基强的松龙组组问差异不显著（P〉0．05）。 结论：电针可使Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达下调，从而抑制细胞凋亡，保护神经细胞，对损伤脊髓的修复有积极的治疗作用，其效果与甲基强的松龙相似。     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的：观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化，验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法：实验于2002-05／2003-10在教育部重点实验室复日．大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为5组：分组情况：①正常对照组6只，杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液，其余4组均完成造模过程，杏仁核内注射红藻氨酸0．5μg溶于0．5μL的磷酸缓冲液中，pH值调至7．4。②单纯癫痫组36只，根据处死大鼠的时问点分为0，2，4，8，24，72h6组，6只／组，癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只，脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只，脑室内注射磷酸缓冲液：⑤空白对照组6只，脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液结果判定：①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化，以癫痫发作前10mln的脑血流为基线，计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果：共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化，双侧脑灌注率波动范围在10％以内。②脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可减少TUNEL阳性细胞，增加存活的神经元。③正常对照组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在脑神经元内构成性表达主要分布于神经元细胞核周围；单纯癫痫组癫痫发作终止24h时同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3弥散于部分神经元的整个细胞，即免疫反应性增强。结论：①癫痫大鼠发作时脑灌注率波动较小，局部腩血流无明显变化，说明其神经元凋亡与脑缺血无关。②给予半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可明显减少大鼠癫痫侧脑海马CA3区神经元的凋亡，增加存活的神经元。提示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在介导癫痫大鼠神经元的凋亡中发挥了作用。     

胶质细胞源性神经营养因子对大鼠局灶脑缺血损伤的作用

目的 研究胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对大鼠局灶性脑缺血的作用及其机制。方法 健康雄性Wistar大鼠120只，随机分为GDNF组和生理盐水组，每组又分为假手术组、缺血0，3，6，24h组，采用大脑中动脉线栓模型，于栓塞同时大鼠脑室内分别给予GDNF和生理盐水。检测脑梗死体积百分比、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）的表达、细胞凋亡等改变。结果 GDNF组脑梗死体积比明显小于生理盐水组；神经元损伤明显轻于生理盐水组，特别是海马区神经元在GDNF组无明显损伤；GDNF组Cas-pase-3和TUNEL染色阳性细胞数少于生理盐水组。结论 GDNF对大鼠局灶性脑缺血有保护作用，抑制Caspase-3的表达和细胞凋亡是其保护机制之一。     

小鼠短暂前脑缺血海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达形式的变化

背景：脑缺血再灌注损伤后，细胞凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达量及蛋白酶活性明显增加，针对其磷酸化与去磷酸化两种形式进行观察，了解其在脑缺血再灌注损伤时的变化情况。目的：观察脑缺血再灌注时小鼠脑海马区中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达形式的变化。设计：随机对照实验。单位：首都医科大学生物化学与分子生物学系。地点和材料：实验于2003-06在首都医科大学附属北京朝阳医院高压氧科实验室进行。按随机数字将30只雌性SPF级C57BL／6N小鼠分为假手术组、缺血再灌注6，12，24和48h5组，每组6只小鼠。方法：缺血再灌注的4组小鼠夹闭双侧颈总动脉20min后再通血流．建立前脑缺血再灌注动物模型，分别于再灌注6，12，24及48h取脑海马；假手术组不夹闭颈总动脉，24h后取脑海马。用蛋白免疫印迹法测定脑海马中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3酶原表达的变化。主要观察指标：各组小鼠脑海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原总量，及其磷酸化和去磷酸化水平比较。结果：经补充后30只小鼠进入结果分析。①脑海马区总半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：缺血再灌注12，24h组显著高于假手术组（9133．1&;#177;2216．3，9355．9&;#177;1901．6，P〈0．05）。②去磷酸化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：缺血再灌注24h组显著高于假手术组（7812．0&;#177;1625.1，3825.8&;#177;155．6，P〈0．05）。③磷酸化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：各组与假手术组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：结果提示脑缺血再灌注损伤诱发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达增加；其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原去磷酸化水平升高明显，说明脑缺血再灌注损伤可能诱发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原去磷酸化，继而促进其转化为活性形式。     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子,脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡.目的观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化,探讨其与神经细胞凋亡发生的关系,为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据.设计自身对照、相互对照动物实验.单位华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科.材料实验于2001-09/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.54只SD大鼠,雌雄不限,体质量220～250g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.方法①动物模型建立及分组将大鼠分为对照组和损伤组,对照组仅做Ts,T9椎板切除术,损伤组于4、8 h和1,2,3,7,14和21 d取材共9组,每组6只.以30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,按Nystrom法暴露T8,T9节段胸髓,将50 g重物通过2.2 mm×5.0 mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min,损伤后每天1000,1600和2200 3次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空.②取材及切片准备在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长,将每组4只损伤段脊髓组织块,长约8 mm,石蜡包埋,连续切片,分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabeling,TUNEL)标记;每组2只在冰上处死,将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用.③检测指标以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA的表达变化,以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平,并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性.主要观察指标①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察.②免疫组化结果.③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化.④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性.结果纳入结果分析的各组动物数均为6只.①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果损伤段1 h有广泛出血;4～8 h脊髓结构开始破坏,大量的神经元死亡;24 h脊髓破坏严重;7～21 d损伤范围确定,脊髓内有空洞形成.②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达(2.1±0.5);脊髓损伤后8 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加(89.2±10.5),3 d达到高峰(189.6±12.7);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似,呈正相关(r=0.941).③逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA 4 h开始增高(0.442±0.024),48 h达到高峰(0.634±0.028),7 d后恢复正常(0.351±0.013),早于凋亡出现的时期,与神经细胞凋亡水平呈正相关(~0.622).4④rUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果对照组及4 h组仅见偶染细胞,8 h后开始出现阳性细胞,主要位于灰质中;此后阳性细胞逐渐增多,3 d达到高峰,7 d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少,主要在周围白质中,14和21 d可见少量的阳性细胞.结论在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在;大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强,8 h开始大量表达,24～48 h达到高峰,与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠,从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看,与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.从本实验可以看出,从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗,应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48 h内应用.     

不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切半胱氨酸蛋白酶3的活性及坐骨神经损伤后的表达变化

目的：观察不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况及其在坐骨神经损伤后的表达变化，并分析其与脊髓细胞凋亡的关系。 方法：实验于2004-03／09在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择Wistar大鼠324只，成年、幼年、老年大鼠各108只。不同年龄组动物均随机分为对照组和手术组，对照组12只为非手术组；手术组共96只．分为术后1d，3d．1周、2周、3周、4周、5周、6周8个时间组，每组12只。各手术组大鼠均在戊巴比妥钠麻醉后，切除股方肌下缘约6mm的坐骨神经。大鼠脊髓细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测法，原位缺口末端标记阳性细胞及Annexin V阳性细胞即凋亡细胞；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况应用免疫组化法检测；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性应用Activity Assay试剂盒检测。 结果：所有大鼠全部进入结果分析，无脱失。①脊髓细胞凋亡情况的原位缺口末端标记及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测结果：正常成年及老年大鼠未见明显标记的阳性细胞，正常幼年大鼠可见个别阳性标记细胞，坐骨神经损伤诱导脊髓神经细胞凋亡的高发时间为伤后2-4周，老年大鼠细胞凋亡持续时间较长。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。不同年龄大鼠Annexin V阳性细胞出现时间均早于原位缺口末端标记阳性细胞。②天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性及表达情况比较：幼年正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达及天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性均高于成年及老年大鼠（P〈0．01），损伤后各年龄组均有明显变化，幼年正常组损伤后1d天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3开始升高，升高时间早于成年及老年组。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：脊髓细胞凋亡情况与天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性测定结果有较好的相同改变趋势，提示天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标。不同年龄大鼠正常时脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达以其在坐骨神经损伤后的表达变化存在差异，说明针对不同年龄段发生的周围神经损伤，其促进神经再生调控时期不同。     

海马局部脑组织血流量和神经元特征性变化与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8介导癫痫大鼠的关系

目的:检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8在癫痫大鼠海马神经元的表达及其与癫痫发作大鼠局部脑血流量和神经元变化的关系。方法:实验于2002-05/2003-10在复旦大学神经病研究所完成。选择清洁级SD雄性大鼠60只,随机分为①正常对照组6只:杏仁核注射磷酸盐缓冲液。②空白对照组6只:磷酸盐缓冲液(脑室)+磷酸盐缓冲液(杏仁核内)。③单纯癫痫组36只:杏仁核内注射红藻氨酸诱发癫痫发作,发作1h后经股静脉注射安定(30mg/kg)终止发作,根据处死大鼠的时间点分0,2,4,8,24,72h6组,每组6只大鼠。④试验给药组6只:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk(脑室,0.3μg于红藻氨酸注射前20min,5min及红藻氨酸注射后1h分3次给药)+红藻氨酸(杏仁核内)。⑤实验对照组6只:磷酸盐缓冲液(脑室)+红藻氨酸(杏仁核内);均于安定注射终止发作后24h处死大鼠。结果评估:①激光多普勒血流测定仪记录局部脑血流。②用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色和cresylviolet染色观察海马神经元凋亡和存活的变化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk对海马CA3区的脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞和存活细胞的影响。③用免疫荧光和蛋白印迹检测海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的表达。结果:造模过程中有2只大鼠死亡,     

电针对急性脊髓损伤后Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的:观察电针治疗对大鼠脊髓损伤后神经细胞再生修复过程中Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响,并与甲基强的松龙进行阳性对照。方法:实验于2003-04/2004-06在佳木斯医学院中心实验室进行。①将健康成年Wistar大鼠64只单纯随机分为模型组、电针组、甲基强的松龙组及假手术组4组(n=16),除假手术组外,其他3组大鼠采用改良的Allen’s捶击法(50g·cm)制成大鼠T10脊髓损伤模型,假手术组仅切除椎板,不损伤脊髓。②电针组在损伤后即刻取督脉上的大椎和命门两(进行治疗,电针频率2Hz,疏密波形,强度2.5mA,以针刺处肌肉轻微抖动为宜,持续30min。甲基强的松龙组在损伤后即刻尾静脉内注射30mg/kg甲基强的松龙。模型组和假手术组不做治疗。③各组分别于术后6,24h各处死8只。应用免疫组织化学方法及图像定量分析法观察各组脊髓损伤早期Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。结果:经补充后61只大鼠进入结果分析。①脊髓损伤后6h:电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组(P<0.05),灰度值高于假手术和模型组相(P<0.05,0.01)。②脊髓损伤后24h:电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组和模型组(P<0.05),灰度值高于假手术和模型组(P<0.05,0.01);但电针与甲基强的松龙组组间差异不显著(P>0.05)。结论:电针可使Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达下调,从而抑制细胞凋亡,保护神经细胞,对损伤脊髓的修复有积极的治疗作用,其效果与甲基强的松龙相似。     

乌龙丹对大鼠局灶性脑缺血神经元凋亡及其相关基因表达的影响

目的：观察乌龙丹对大鼠局灶性脑缺血神经元损害病理过程的保护作用，并分析其作用途径。 方法：实验于2004—09/2005—10在南方医科大学中医药学院实验室完成。①选用Wistar大鼠30只，3-4月龄，体质量（250&;#177;20）g。按随机抽签法将大鼠分为5组（每组6只）：假手术组：只做开颅术，不结扎血管；模型组和乌龙丹低、中、高剂量组：造成局灶性脑缺血模型。乌龙丹低、中、高剂量组：造模前灌胃乌龙丹流浸膏[乌龙丹由生黄芪、葛根、制首乌、川芎、丹参、地龙、全蝎、制僵蚕、水蛭．生晒参、石菖蒲、女贞子、白术、当归组成，由南方医科大学南方医院中药房提供，加工为流浸膏（含生药2．5g／mL）]1，2，4mL，给药7d；假手术组：术前灌胃2mL生理盐水，干预7d；模型组：造模前灌胃2mL生理盐水，干预7d。②于末次给药后2h造模：结扎右侧颈总动脉，夹闭左侧颈总动脉1h后放开；阻断大脑中动脉造成局灶性脑缺血模型。③大鼠造模24h后，剥取脑组织，冠状连续切片。在JEM1200-EX透射电镜下观察脑组织的超微结构。采用原位末端标记法，按试剂盒说明书方法操作，应用图形分析仪系统，计算原位末端标记法染色阳性细胞数（细胞凋亡数）。采用免疫组化法，按试剂盒说明书方法操作检测Bcl-2与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达情况。④组间计量资料差异比较采用单因素方差分析. 结果：Wistar大鼠30只均进入结果分析。①假手术组：神经细胞形态正常。模型组：神经细胞有明显病理改变，神经元肿胀或浓缩，有凋亡细胞表现。乌龙丹3个剂量组：多数细神经细胞胞保存完好，神经细胞基本形态结构完整，与假手术组相似。②模型组脑组织原位末端标记法染色阳性细胞、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3免疫反应阳性细胞数明显多于其他4组（P〈0.05），Bcl-2免疫反应阳性细胞数明最少于其他4组（P〈0．05）。乌龙丹低、中、高剂量组神经细胞凋亡情况与相关基因表达与假手术组相近。 结论：乌龙丹具有减轻局灶性脑缺血神经细胞结构的病理损伤，对抗细胞凋亡的神经保护作用，该作用发挥可能与乌龙丹影响脑缺血后Bcl-2，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3基因表达有关。     

一氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察急性一氧化碳中毒后脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化及氯化血红素对上述两者表达变化的影响。方法：实验于2005-10／08在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。150只雄性SD大鼠随机分成3组，每组50只。①一氧化碳中毒组：大鼠放入染毒罐，静式吸入一氧化碳与空气的混合气60min。造模后分别于1，3，5，7和14d处死，每个时间点10只大鼠。②氯化血红素治疗组：除给予一氧化碳中毒组同样的处理外，于造模后立即注射氯化血红素（30mol／kg，3次／d）直至相应时间点处死，每个时间点10只大鼠。③对照组：不作任何处理，在相应时间点处死。各组大鼠分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法，观察大鼠脑内的脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化。结果：150只大鼠均进入结果分析。①免疫组化阳性神经细胞数目：一氧化碳中毒组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目持续下降，至中毒后14d最低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞逐渐增多，至中毒后5d达高峰，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。经氯化血红素治疗后，与中毒组相比脑红蛋白的表达明显增多，与中毒组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的阳性细胞数明显下降，与中毒组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。②免疫蛋白印迹灰度分析：一氧化碳中毒组脑红蛋白的表达持续下降，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达上升，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；氯化血红素治疗组与中毒组相比，脑红蛋白表达量上升（P〈0．01）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达下降，治疗5d最显著（P〈0．01）。结论：一氧化碳中毒后大鼠脑红蛋白表达呈持续下降；刺激脑红蛋白表达可抑制急性一氧化碳中毒后大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。     

光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死肿瘤坏死因子α表达及髓过氧化物酶活性的变化

目的：分析光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死模型脑组织肿瘤坏死因子α表达和髓过氧化物酶活性的变化规律及其相关性。 方法：实验于2004—07／2005—07在泰山医学院脑微循环实验室完成。选用雄性KM小鼠60只，随机分为3组，正常对照组（n=6）、假手术组（n=6）、局灶性脑梗死组（n=48），局灶性脑梗死组按光照后时间分为30min，1，3，6，12，24，48，72h8个亚组，每亚组6只。采用光化学法制作小鼠局灶性脑梗死模型，假手术组除不作光照外其他操作同局灶性脑梗死组。采用免疫组化、酶联免疫吸附法检测梗死侧皮质肿瘤坏死因子α的表达，比色法检测梗死侧皮质髓过氧化物酶的活性，髓过氧化物酶活性可以反映组织中中性粒细胞的浸润程度，活性越高浸润越严重。 结果：60只小鼠均进入结果分析。①脑梗死后肿瘤坏死因子α阳性细胞主要为神经元及胶质细胞，分布于梗死区及其周围。假手术组皮质肿瘤坏死因子α的表达量为（615．7&;#177;16．1）ng／L，局灶性脑梗死组于光照后3h开始明显升高（792．2&;#177;17．8）ng／L，6h达高峰（921．9&;#177;23．9）ng/L，12h开始下降（848．0&;#177;30．6）．s／L，72h恢复至正常水平（625．3&;#177;14．3）ng／L。②假手术组皮质髓过氧化物酶的活性为（7．151&;#177;0．433）nkat／g，局灶性脑梗死组于光照后3h开始明显升高（10．469&;#177;0．600）nkat／g，12h达高峰（15．486&;#177;0．650）nkat／g，24h开始下降（11．052&;#177;0．617）nkat／g，72h恢复至正常水平（7．418&;#177;0．617）nkat／g。③髓过氧化物酶活性变化稍滞后于肿瘤坏死因子α的表达，相关性分析示二者呈正相关（r=-0．953，P〈0．01）。 结论：在光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死急性期，肿瘤坏死因子α表达水平与髓过氧化物酶活性呈正相关，提示肿瘤坏死因子α可诱导炎性细胞侵入缺血脑组织，参与脑缺血早期的炎症反应过程。     

局灶性缺血预处理对脑缺血耐受大鼠神经营养因子表达的影响

目的：观察局灶性缺血预处理对脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达影响，探讨神经营养因子与缺血耐受的关系及其在内源性保护机制中的作用。方法：实验选用30只SD大鼠，随机将30只大鼠分为实验组、假手术组、对照组，每组10只。利用线栓法建立局灶性脑缺血耐受的动物模型。实验组预缺血10min，3d后给于缺血2h，再灌注22h处死。假手术组暴露解剖结构10min，3d后同实验组；对照组两次均为假手术。运用对脑梗死体积的测定、光镜下组织病理改变及免疫组织化学染色和图像分析比较各组BDNF的表达变化。结果：假手术组梗死体积【(126．0&;#177;22．4)mm^3】与预缺血组【(102．0&;#177;24．2)mm^3】比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。假手术组病理改变最为明显，实验组病理改变明显轻于假手术组，仍可见皮质和基底核神经细胞溶解，核皱缩，但可见尚存的大脑皮质的正常神经元排列结构。对照组未见明显的病理改变。本实验中BDNF蛋白阳性细胞表达定位于胞浆呈棕黄色。假手术组阳性细胞的平均吸光度(A值)与对照组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。实验组阳性细胞的平均A值与假手术组、对照组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：局灶性缺血预处理对随后的脑梗死有明显的保护作用，能够诱导缺血耐受的产生，其可能的机制是通过上调BDNF的表达。     

N-已酰半胱氨酸对大鼠脑梗死灶体积及caspase-1蛋白表达的影响

目的观察N -已酰半胱氨酸(NAC)对成年大鼠局灶性脑缺血后脑梗死体积及凋亡基因caspase- 1表达的影响。方法70只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、缺血组和NAC组,NAC组于大脑中动脉栓塞后30 min腹腔注射NAC 150 mg/kg,比较缺血组和NAC组的梗死灶体积、caspase -1免疫组化阳性细胞数。结果NAC组24 h~7 d各检测时间点的梗死灶体积小于缺血组,caspase -1免疫组化阳性细胞数少于缺血组( P <0.01)。结论NAC有减小持续性局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶体积、抑制细胞凋亡的作用,且可能与抑制caspase- 1蛋白表达有关。