抗人NRP1单克隆抗体的活性鉴定及初步应用

目的鉴定抗人神经菌毛素1(neuropilin1,NRP1)单克隆抗体的生物活性并利用该抗体检测常见肿瘤细胞株NRP1蛋白的表达情况。方法腹水法制备4株抗NRP1单克隆抗体并用rProtein A亲和柱纯化抗体,间接ELISA检测4株抗体的滴度水平,Western blot分析4株抗体结合NRP1蛋白的特异性,流式细胞术分析4株抗体结合NRP1蛋白的亲和力,共聚焦免疫荧光实验进一步验证抗体结合NRP1蛋白的能力;细胞免疫组织化学染色检测14株肿瘤细胞表达NRP1蛋白的情况。结果 4株抗体均能特异结合NRP1蛋白,其中A6结合NRP1能力最强,能结合在表达NRP1蛋白的细胞膜表面。细胞免疫组织化学染色结果显示NRP1在HepG2、C6、HEK293、BEL-7402、MDA-MB-453呈高水平表达,在U87、MGC803、MCF7、MDA-MB-231中表达水平相对较弱,而在U251、BGC823、H6、HT-29的表达介于两者之间,在SMMC-7721细胞中未检测到表达。结论 4株抗NRP1单克隆抗体均能特异结合NRP1蛋白,多种肿瘤细胞株均不同程度表达NRP1蛋白,为进一步探讨NRP1蛋白与肿瘤发生发展的关系奠定了基础。     

神经菌毛蛋白1的研究进展

神经菌毛蛋白1(NRP1)是NRP家族的重要一员,其作为多种细胞外基质配体的共受体在神经发育、血管生成、肿瘤侵袭转移和免疫等方面发挥重要作用。NRP1可通过多种机制促进肿瘤的血管生成和肿瘤增殖转移,同时在免疫系统中可调节初级免疫反应并且是抗肿瘤免疫的关键因素。NRP1的进一步研究将为神经系统、血管系统及肿瘤的治疗提供新的方向和机遇。     

Neuropilin-1在CD4+ CD25+ T细胞上的表达

目的 探讨neuropilin-1(NRPl)在外周血中CIM+ CD25+ T细胞上的表达以及意义.方法 收集肾移植术后长期存活、慢性移植物肾病和急性排斥患者以及健康成年人的外周血,分离外周血淋巴细胞,用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞中CD4+ CD25+ T细胞上NRPl和Foxp3的阳性细胞的百分比.结果 各组CD4+ CD25+ T细胞NRPl的表达率差异有统计学意义(P＜0.05);各组CD4+ CD25+ T细胞Foxp3的表达率差异亦有统计学意义(P＜0.05).长期存活组CD4+ CD25+ T细胞上NRP1和Foxp3表达率分别为19.6%±3.84%、50.19 ±3.90%,显著高于对照及慢性移植物肾病和急性排斥组(P＜0.05);急性排斥组的CD4+ CD25+ T细胞NRP1和Foxp3表达率最低4.64%±1.26%、17.24%±5.29%.各组CD4+ CD25+ T细胞NRP1表达变化趋势与Foxp3变化趋势相同.结论 NRP1在长期存活组的外周血淋巴细胞中CD4+ CD25+ T细胞的表达上调,在急性排斥组时表达下调,且其在各组的表达变化趋势与Foxp3的表达变化趋势是一致的,这就提示CD4+ CD25+ NRP1+ 细胞是一群调节性T细胞,即NRP1是CD4+ CD25+ Treg的一个重要的表面标志.     

胃癌中VEGF、NRP1和干细胞标志物CD44的表达及相关性

目的探讨VEGF、NRP1和干细胞标志物CD44在胃癌组织中的表达及三者间的相关性。方法应用高通量组织芯片技术和免疫组化SP法检测72例胃癌和52例正常胃组织中VEGF、NRP1和CD44蛋白的表达,并分析三者之间的相关性以及与胃癌临床病理特征的关系。结果 (1)胃癌组织中VEGF、NRP1和CD44蛋白阳性率分别为76.4%、66.7%、83.3%,三者在胃癌组织中的表达显著高于正常胃组织,差异均具有统计学意义(P均<0.01)。(2)VEGF、NRP1蛋白表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05);CD44表达与Lauren分型、分化程度、淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05)。(3)胃癌组织中VEGF、NRP1和CD44蛋白的表达均呈正相关(rs=0.578,rs=0.278,rs=0.316,P均<0.05)。结论 VEGF、NRP1和干细胞标志物CD44在胃癌中均呈高表达,且与胃癌的恶性生物学行为密切相关。VEGF与NRP1之间可能存在协同作用,二者均与干细胞标志物CD44的表达密切相关,其具体机制有待进一步研究。     

MicroRNA-9通过NRP1抑制胃癌SGC-7901细胞上皮-间充质转化功能

目的:研究微小RNA-9(microRNA-9,miR-9)对胃癌SGC-7901细胞上皮-间充质转化(EMT)功能的影响及其相关机制。方法:SGC-7901胃癌细胞株分别转染miR-9 mimics和阴性对照序列(negative control mimic,NCM),作为miR-9组和NCM组,并设立未转染对照(control)组,采用RT-qPCR法检测各组细胞miR-9的含量,Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力,Western blot法检测3组细胞的N-cadherin、E-cadherin、α-catenin和神经纤毛蛋白1(NRP1)表达水平。采用Western blot法检测NRP1过表达对miR-9抑制EMT的拮抗作用。双萤光素酶实验检测miR-9与NRP1的关系。结果:miR-9组的miR-9表达水平明显上调,为control组的538倍(P0.05)。miR-9组的迁移细胞数量明显低于control组(P0.05)。miR-9组的侵袭细胞数量明显低于control组(P0.05)。miR-9组细胞的N-cadherin和NRP1蛋白表达量明显降低,E-cadherin及α-catenin蛋白表达量明显升高。而NRP1及miR-9均过表达组胃癌细胞中N-cadherin蛋白表达量明显升高,E-cadherin及α-catenin蛋白表达量明显降低。双萤光素酶检验结果显示NRP1为miR-9的下游靶基因(P0.05)。结论:miR-9可能通过降低下游靶基因NRP1水平影响EMT相关蛋白表达,抑制胃癌SGC-7901细胞的EMT功能。     

miR-212通过靶向NRP1调节结肠癌SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答北大核心CSCD

目的:探讨miR-212在SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答中的调控作用,并初步分析其调控机制。方法:结肠癌SW480细胞分别转染mimic、miR-NC或miR-212-5p,RT-PCR检测神经纤毛蛋白1(NRP1)和miR-212-5p表达水平并进行相关性分析;TargetScan预测miR-212-5p潜在靶向基因NRP1,荧光素酶实验验证靶向关系;SW480细胞单独或联合转染miR-212-5p和pcDNA-NRP1,RT-PCR检测miR-212-5p和NRP1 mRNA表达水平,Western blot检测NRP1蛋白表达水平;流式细胞术分选干细胞阳性标记(CD44+)比例,Western blot检测性别决定区Y框蛋白2(SOX2)和富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)蛋白表达;ELISA测定SW480细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL-4蛋白含量,RT-PCR检测IL-6和IL-4 mRNA表达水平。结果:与Control组相比,miR-212-5p显著上调SW480肿瘤干细胞miR-212-5p表达(P<0.05),下调NRP1表达(P<0.05),抑制CD44+、SOX2、LFR5表达(P<0.05),促进炎症反应和免疫应答(P<0.05);与NRP1组相比,miR-212-5p明显抑制因NRP1上调的CD44+、SOX2和LGR5表达(P<0.05),促进因NRP1下调的炎症因子表达(P<0.05)。结论:miR-212-5p靶向抑制NRP1表达,调节结肠癌SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答。     

NRP-1、P53和CD34在大肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨大肠癌组织中P53、NRP1和CD34表达的意义及相关性。方法选取62例大肠癌和30例正常大肠粘膜组织标本,采用免疫组化方法检测正常大肠粘膜及大肠癌组织中P53的表达,免疫组化和Western blot方法检测正常大肠粘膜及大肠癌组织中NRP1和CD34表达情况,测定微血管密度,并进行相关性分析。结果免疫组化结果发现,NRP-1和p53在大肠癌组织的阳性表达率显著高于正常大肠粘膜组(P<0.05),CD34阳性产物MVD值大肠癌组显著高于正常大肠粘膜组(P<0.05)。Western blot结果显示,与正常粘膜组织相比,大肠癌组织中NRP1、CD34的表达水平显著升高(P<0.05)。结论 NRP-1、p53、CD34在大肠癌组织中过表达并呈正相关。     

NRP1调控M2型巨噬细胞极化介导电离辐射肺纤维化的作用研究

目的：研究神经菌毛蛋白1(NRP1)对电离辐射肺损伤导致纤维化进程的影响，并探讨其与M2型巨噬细胞间的关系。方法：电离辐射肺纤维化（RIPF）组小鼠以6 Gy X射线全胸辐射建立电离辐射肺纤维模型；对照组即正常小鼠；EG00229给药组（EG00229为NRP1拮抗剂）小鼠辐射前7 d小鼠EG00229给药处理。HE、天狼星红、马松染色观察三组小鼠肺组织损伤和纤维化胶原沉积；ELISA检测三组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1炎症因子水平；IHC和RT-PCR检测三组小鼠肺组织中Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和NRP1蛋白表达水平；免疫荧光检测三组小鼠肺组织中CD14和M2型巨噬细胞极化标志物精氨酸酶1(Arg1)、抵抗素样分子α(FIZZ1)、几丁质酶3样蛋白1(Ym1)蛋白表达水平。结果：HE染色显示RIPF组小鼠肺部呈现放射性肺纤维化病理形态表现，EG00229给药组小鼠肺组织纤维化损伤有明显改善；与对照组相比，RIPF组小鼠肺组织中Col-Ⅰ、α-SMA和NRP1及TNF-α、IL-4、TGF-β1和CD14表达水平显著升高，EG0022...     

NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究

目的利用合成的HLA-A02限制性NY—ESO-1 p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽,体外通过抗原递呈细胞诱导HCC患者外周血T淋巴细胞,从而成功诱导出特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。方法通过SSP方法筛选20例HLA—A＊02的HCC患者的HLA亚型;通过逆转录多聚酶链反应和测序分析NY—ESO-1和MAGE—A3在肝癌组织中的表达以及多肽表位密集区的核苷酸变异状况;体外用细胞因子培养HCC患者外周血来源的树突状细胞（DC）;人工合成HLA—A＊02限制性NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3 p271—279多肽,直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外同T淋巴细胞孵育16d后,利用Elispot、细胞内细胞因子染色和四聚体实验检测T细胞免疫应答。结果20例HLA—A＊02患者中,NY-ESO-1mRNA阳性患者为11例,MAGE—A3mRNA阳性患者12例。中国HCC患者表达的NY—ESO-1和MAGE—A3序列高度保守。经多肽直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外活化外周血T淋巴细胞,4例（36．4％）NY—ESO-1阳性HCC患者以及4例（33．3％）MAGE．A3患者产生针对多肽特异性的CD8’T细胞免疫应答。不同HLA—A＊02亚型HCC患者可产生针对NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽的免疫应答。结论NY—ESO-1p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以诱导出针对抗原肽的特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。提示HLA—A＊02限制性的NY-ESO-1 p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

衰老1型星形胶质细胞的Aβ1-40及相关分子表达变化

目的:通过体外建立1型星形胶质细胞(T1A)衰老模型,研究衰老T1A中β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)及相关蛋白的表达变化。方法:采用振荡培养与差速贴壁法分离纯化新生SD(Sprague-Dawley)大鼠的T1A,免疫细胞化学标记检测体外培养21d(21DIV)及90d(90DIV)的T1A中β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)的表达;以WesternBlot检测微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)、caspase-3及Bcl-2的表达水平。结果:体外长程培养的T1A中Aβ1-40蛋白表达增加,同时90DIV组细胞中LC3II及活化的caspase-3表达水平提高,Bcl-2表达水平降低。结论:研究结果提示衰老的T1A表达Aβ,细胞内自噬及凋亡活性增强,在年龄相关的神经变性过程中,T1A的衰老可促进神经元的损伤,衰老T1A表达的Aβ很可能是Alzheimer病老年斑的重要来源。     

NRP2和COUP-TFⅡ在大肠癌组织中的表达

目的探讨神经纤毛蛋白2(NRP2)和鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)在大肠癌组织中的表达。方法选取57例大肠癌组织和29例正常大肠黏膜组织,将其分别设置为实验组与对照组。采取免疫组织化学方法和Western blot方法对两组大肠黏膜组织标本中NRP2和COUP-TFⅡ的蛋白表达水平进行检测,分析在大肠癌组织中NRP2与COUP-TFⅡ表达的相关性。结果大肠癌组织中NRP2与COUP-TFⅡ蛋白阳性表达的光密度值显著高于正常大肠黏膜组织。Spearman相关分析结果显示,大肠癌组织中NRP2与COUP-TFⅡ的表达呈正相关。结论 NRP2与COUP-TFⅡ的高表达与大肠癌的发生发展有关,可作为重要的生物学标志。     

甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学调查

目的了解甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性及分子流行病学特点。方法采用纸片扩散法及琼脂稀释法检测2002年从北京协和医院住院患者分离的165株MRSA的耐药性；采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中重症监护病房(ICU)和呼吸重症监护病房(RCU)分离的65株MRSA作同源性分析。结果165株MRSA对万古霉素和替考拉宁的敏感率为100％，对庆大霉素的耐药率为100％；对左氧氟沙星、四环素、红霉素耐药率分别为98．2％、96．3％、93．9％。对甲氧苄啶，磺胺甲噁唑和氯霉素敏感率分别为95．8％及98．8％；ICU和RCU病房分离MRSA的PFGE图谱有5种类型(A—E型)，以A型为主(56株)，A型又包括A1亚型(55株)和A2亚型(1株)。结论医院获得性MRSA是多重耐药菌，在ICU和RCU病房发生了基因型为A1亚型的MRSA菌株暴发流行。     

体外重组表达血管生长因子VEGF165单克隆抗体的制备及鉴定

目的:研制人VEGF165单克隆抗体(mAb),为研究VEGF165的生物学活性提供基础.方法:应用RT-PCR从脐静脉内皮细胞中克隆人VEGF165基因,克隆人原核表达载体pGEX-6P1中获得重组表达载体pGEX-6P1 -VEGF165,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得重组人VEGF165蛋白,将重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,制备人VEGF165高效价的mAb.通过鸡胚血管形成抑制实验、HUVEC迁移抑制实验以及HUVEC血管形成抑制实验,对获得的人VEGF165特异性mAb进行进一步鉴定.结果:成功地从脐静脉血管内皮细胞中克隆出人VEGF165基因,并在大肠杆菌表达系统中获得高效表达,以纯化重组蛋白作为免疫原免疫小鼠,筛选获得5株分泌人VEGF165特异性mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为5A6、3F5、6H3、7D10、7A10,其中5A6、3F5、6H3、7D10分泌的mAb亚类为IgG2a,7A10分泌的mAb亚类为IgG2b,抗体轻链均为κ链.5株mAb均能抑制鸡胚血管形成、抑制HUVEC迁移和及血管形成.结论:所获得的mAb具有效价高,活性强的优点,为抗肿瘤血管研究中进一步研究VEGF165的生物学作用提供了重要的基础.     

人血管内皮生长因子受体胞外1-3、2-3 loopcDNA在酵母中的表达及其生物学活性研究

目的 在酵姆 中实现人血管内皮生长因子（hVEGF165)受体FLT-1胞外1-3及2-3loopcDNA的高效分泌性表达,并比较两种表达产物的生物学活性。方法 构建酵母重组表达质粒pPIC9K/FLT-1(1-3)及pPIC9K/FLT-1(2-3),并分别转化酵母宿主菌CS115,表达产物经CM-SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS-100分子筛层析纯化后测定其生物学活性。结果 SDS-PACE显示,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4d的表达量占上清总蛋白的60%以上。表达的sFLT-1（1-3）及sFLT-1(2-3)都具有结合hVEGF165的能力和抑制hVEGF165对人脐静脉内皮细胞（HUVC）的促增殖功能,其中前者的作用虽较强,但二者相差不大。结论 获得了具有生物学活性的可溶性重组TLT-1受体胞外区1-3及2-3loop小片段,为进一步的动物实验和临床应用提供有益的资料。     

淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展

NRP2是新近发现的淋巴管内皮细胞受体,其能与血管内皮细胞生长因子VEGFC/D结合,诱导肿瘤原有及新生淋巴管生成、分化和重构,促进肿瘤细胞向淋巴道迁徙、侵袭和转移。NRP2受体不仅是连接、启动、激活细胞外配体和细胞内信号通路的中枢结点,更是反映不同解剖学部位、不同组织学类型、不同发生发展阶段肿瘤特性的良好指标。了解NRP2受体结构功能的生化意义,确定其在VEGFC/D-NRP2反应轴中的核心地位,分析其与VEGFR3、NRP1等同类受体之间的相互关系,观察其在肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移时的表达规律,阐明其可能涉及的分子生物学机制,具有重要意义。     

MAGE-A1/A3蛋白在胶质瘤的表达及意义

从蛋白水平检测黑色素瘤抗原(melanoma antigen,MAGE)-A1/A3在胶质瘤的表达情况,为MAGE-A1/A3蛋白用于胶质瘤的疾病发展预测及免疫治疗提供依据。免疫组织化学方法检测50例胶质瘤中MAGE-A1/A3的表达,检测结果用SPSS13.0统计学软件进行处理,并分析两者的表达与肿瘤临床病理特征的相关性。MAGE-A1/A3在胶质瘤中的表达率分别是54.0%及56.0%,胶质瘤中MAGE-A1和A3的表达率差异无统计学意义(P>0.05);MAGE-A1/A3同时表达率为40.0%(20/50);MAGE-A1/A3在胶质瘤中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的部位无相关性(P>0.05),而与胶质瘤的病理分级相关(P<0.05)。MAGE-A1/A3蛋白高表达于胶质瘤,且与病理变化相关,提示MAGE有望作为胶质瘤疾病发展预测指标及免疫治疗的靶抗原。     

VEGF165对兔动脉粥样硬化斑块影响的实验研究

目的观察VEGF165对动脉粥样硬化斑块形成与发展的影响.方法利用高胆固醇饲料复制动脉粥样硬化兔模型.15只日本大耳白兔随机分为3组,A组,阴性对照组,仅给普通饲料喂养,B、C组给高胆固醇饲料喂养,喂养到第3周(21 d),A组及B组肌注白蛋白(2 μg/kg),C组肌注VEGF165(2 μg/kg),继续以前的方式饲养3周(42 d)处死动物,截取胸主动脉进行计量组织学及免疫组织化学分析.结果 (1)斑块面积(A组 0%,B组 1.81%±0.61%,C组 24.12%±3.58%),斑块周径(A组 0,B组 6.05%±1.62%, C组 25.71%±1.97%)及斑块最大厚度(A组 0,B组0.06 mm±0.002 mm, C组 0.16 mm±0.007 mm),三组之间相比有显著性差异(P＜0.05);(2)新生血管密度[CD34阳性细胞数(cells/mm2)A组0, B组 12.35±2.02, C组 61.15±7.55]各组之间比较有显著性差异(P＜0.05);(3)电镜显示新生血管与动脉粥样斑块相邻,新生血管腔内可见淋巴细胞;(4)VEGF组CD34阳性细胞数与斑块面积之间呈正相关(r=0.989,P＜0.001).结论 VEGF165能促进兔动脉粥样硬化斑块的形成与发展.     

2004-2008年我国流行的A型流感病毒抗原性及HA1基因特性的研究

目的 了解我国2004-2008年A(H1N1、H3N2)型流感病毒流行情况、抗原性和基因特性变异关系,了解疫苗株与我国流行株之间抗原性变化情况.方法 选择2004年以来我国分离的A(H1N1、H3N2)型流感病毒进行抗原性及HA1区基因序列,通过比对HA1蛋白位点变异情况,分析我国流感病毒抗原性及基因特性变化情况.结果 A(H1N1)亚型流感毒株抗原性2004-2007年分离的A(H1N1)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)类似;2008年我国流行的A(H1N1)亚型毒株的抗原性与2008-2009年北半球的流感疫苗株A/Brisben/59/2007(H1N1)类似.2004-2005年分离的A(H3N2)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/Fujian/411/12002(H3N2)比较发生了变异;2006-2007年我国流行的H3N2毒株与A/Wiscansin/67/2006(H3N2)类似,2008年我国流行的H3N2毒株与疫苗株A/Brisben/10/2006(H3N2)类似.结论 2004-2008年我国流行的A(H1N1、H3N2)亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变.     

食管癌诊断、分期和预后中多肿瘤抑制基因-1、分泌素-3A1的表达研究

目的:分析食管癌诊断、分期和预后中多肿瘤抑制基因-1(Multiple tumor suppressor gene-1,MTS-1)及分泌素-3A1(Secretoglobin-3A1,SCGB3A1)的表达及临床意义.方法:回顾性分析本院2014年10月至2017年10月期间临床确诊的79例食管癌患者的临床资料,通过...     

ARID1A及PIK3CA突变在EBV相关胃癌中的研究进展

胃癌是发病率及病死率较高的一种恶性肿瘤,其发生、发展是多种因素作用的复杂过程。最新的胃癌分子分型中的EBV相关胃癌(Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma,EBVa GC)与EBV感染有关。近年研究发现,ARID1A(AT-rich interactive domain containing protein 1A)基因和PIK3CA(phosphatidy-linositol 3-kinase catalytic alpha)基因在EBVa GC中的突变率较高,其可能与EBV感染和胃癌的发生有一定关系。该文就近年来ARID1A和PIK3CA在EBV相关胃癌中的研究进展作一综述。