人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值研究

目的 探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法 收集2016年12月~2017年10月在笔者医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜活检的女性病例262例,活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测,以宫颈组织病理活检为标准对照。对比3种方法检测宫颈病变HSIL的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积（AUC）,及3种方法在不同病理级别中的检出情况,并分析HPV E6/E7mRNA病毒载量与病变关系。结果 HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥HSIL的敏感度与HPV DNA基因分型和细胞学相似,特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于细胞学和HPV DNA基因分型;HPV E6/E7mRNA的受试者工作特征曲线下面积（AUC=0.80, P<0.01）高于细胞学（AUC=0.65, P<0.01）和HPV DNA分型（AUC=0.54,P>0.05）的曲线下面积;HPV mRNA和细胞学在不同病理级别中的检出率比较,差异有统计学意义（P<0.01）,HPV DNA基因分型在不同病理级别中的检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）;HPV E6/E7 mRNA表达水平与组织病理分级之间的相关关系有统计学意义（P<0.01）,且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病理分级间呈正相关（r=0.467）。结论 HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型,在宫颈病变及癌变的筛查中具有一定的临床价值,临床医生应给予关注。     

核转录因子κB家族蛋白及HPV E6/E7mRNA与早期宫颈癌复发的关系

目的 探讨核转录因子κB（NF-κB）家族蛋白表达及人乳头瘤病毒（HPV） E6/E7 mRNA水平与早期宫颈癌复发的关系。方法 收集2017年1月至2020年12月在开滦总医院妇产科接受宫颈癌根治术的163例早期宫颈癌患者的临床资料,设为宫颈癌组;另收集医院同期收治的101例非宫颈癌患者的临床资料,设为非宫颈癌组,根据病理结果分为3个亚组：对照组（子宫肌瘤患者,n=31）、低度鳞状上皮内瘤变（LSIL）组（n=26）、高度鳞状上皮内瘤变（HSIL）组（n=44）。比较宫颈癌组与非宫颈癌组及非宫颈癌3个亚组间宫颈组织中c-Rel、p65、p50核表达及HPV E6/E7 mRNA表达情况,分析c-Rel、p65、p50核表达及HPV E6/E7 mRNA在不同临床病理特征宫颈癌患者中的差异性表达,采用Kaplan-Meier法分析c-Rel、p65、p50及HPV E6/E7 mRNA表达与宫颈癌术后无复发生存的关系,Cox法分析宫颈癌术后复发的影响因素。结果 宫颈癌组c-Rel、p65、p50及HPV E6/E7 mRNA阳性率均高于对照组（P＜0.05）,HSIL组c-Rel、p50及HPV E6/E7 mRNA阳性率均高于对照组（P＜0.05）,LSIL组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于对照组（P＜0.05）。c-Rel表达与脉管浸润程度有关,p65表达与FIGO分期、宫旁浸润及淋巴结转移有关,p50表达与间质浸润有关,HPV E6/E7mRNA表达与肿瘤直径、宫旁浸润及间质浸润有关（P＜0.05）。随访36（12~75）个月期间,163例宫颈癌患者复发率为19.63%（32/163）,Kaplan-Meier结果显示,c-Rel、p50阳性患者与阴性患者的无复发生存率差异无统计学意义（LogRankχ²=0.820、3.181,P=0.367、0.075）,p65、HPV E6/E7 mRNA阴性患者无复发生存率分别优于阳性患者（LogRankχ²=10.597、4.474,P=0.001、0.034）。多因素Cox回归分析显示,FIGO分期IIa期、淋巴结转移、p65阳性、HPV E6/E7 mRNA阳性可增加宫颈癌术后复发风险（HR=1.617、1.506、3.180、1.460,P＜0.05）。结论 转录因子NF-κB家族核表达、HPV E6/E7 mRNA表达在宫颈病变进展过程中存在差异,其表达水平与早期宫颈癌多种病理特征有关,且p65、HPV E6/E7 mRNA可影响宫颈癌术后复发,可作为评估早期宫颈癌术后复发的可靠参考指标。     

宫颈组织HPV E6/E7 mRNA Atg-12 Tie-1表达情况与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的 探讨宫颈组织人类乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白-12(Atg-12)、酪氨酸激酶受体-1(Tie-1)表达情况与鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法 选取2020年5月至2021年10月新乡市中心医院病理科诊断为SIL的患者227例,根据宫颈病变分级分为低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组124例和高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组103例,另选取子宫肌瘤手术患者80例为对照组。所有患者均采用支链DNA信号扩增法检测HPV E6/E7 mRNA,采用免疫组化法及免疫印迹法检测Atg-12、Tie-1蛋白。分析E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1与病理分级的相关性,绘制受试者特征(ROC)曲线分析各指标对HSIL与LSIL的鉴别诊断价值。结果 HSIL组的HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白阳性检出率高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白阳性检出率低于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的HPV E6/E7 mRNA拷贝数、Tie-1蛋白表达量高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白表达量低于LSIL组和对照组(P<0.05)。HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白表达量与SIL病理分级呈正相关(r=0.514,0.488),Atg-12蛋白表达量与SIL病理分级呈负相关(r=-0.433)。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1鉴别诊断HSIL与LSIL的灵敏度为88.57%、74.29%、82.86%,特异度为57.14%、66.67%、64.29%。3项指标联合诊断的灵敏度为77.14%,特异度为85.71%(AUC=0.854)。结论 HSIL患者HPV E6/E7 mRNA、Tie-1表达较高,Atg-12表达较低。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1表达与SIL病理分级有一定相关性,联合诊断可为HSIL与LSIL的鉴别诊断提供参考。     

高危HPVE6/E7mRNA对宫颈病变诊断价值的研究

目的 探讨高危HPV E6/E7 mRNA对宫颈病变的临床诊断价值。 方法 根据病理诊断结果的不同分为两组,其中慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级患者共48例为对照组,高级别宫颈病变(包括CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈浸润癌)共42例患者为观察组,分别对上述宫颈细胞标本进行HPV DNA分型检测和高危HPV E6/E7 mRNA检测。 结果 慢性宫颈炎、CINⅠ组中高危HPV DNA的检出率(29.1%)明显高于高危HPV E6/E7 mRNA(8.3%),高级别宫颈病变组中高危HPV E6/E7 mRNA的检出率(85.7%)明显高于高危HPV DNA(64.3%),差异有统计学意义(P<0.05);高危HPV E6/E7 mRNA检测的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值(85.7%、91.7%、90.0%、88.0%)均高于HPV DNA分型检测(64.3%、70.8%、65.9%、69.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 高危HPV E6/E7 mRNA检测在临床诊断过程中大大降低过度检查和治疗的机会,避免了高频率和重复感染给患者带来的经济负担和精神压力。     

宫颈脱落细胞HPVE6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查与 HPV分型诊断中的应用

目的 研究宫颈脱落细胞E6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查与HPV分型诊断中的应用价值。方法 选取2018年3月至2020年3月安康市妇幼保健院收治的268例宫颈癌疑似病变患者作为研究对象,取宫颈脱落细胞作为实验标本,检测E6/E7mRNA阳性率及拷贝数,并行HPV分型检查。以病理诊断为金标准,其中140例纳入宫颈癌组,128例为非宫颈癌组。并对268例患者进行HPV分型,高危型HPV组212例,低危型HPV组15例,低危混合型HPV组41例,记录宫颈癌发生率。采用多因素回归分析宫颈癌与高危型HPV的影响因素,利用受试者工作曲线（ROC）分析各影响因素单项和联合对检测宫颈癌与HPV分型的准确性。结果 宫颈癌组患者E6/E7 mRNA阳性率和拷贝数均高于非宫颈癌组,高危型HPV组患者E6/E7 mRNA阳性率和拷贝数均高于低危型及低危混合型HPV组,差异均有统计学意义（P<0.05）。多因素分析结果显示受教育程度初中及以下（95% CI： 0.187~0.836）、孕次≥3次（95%CI： 1.079~1.625）、初次性生活时间<18岁（95% CI： 1.075~1.611）、鳞状细胞癌抗原（SCC）（95% CI： 1.058~1.782）及HPVE6/E7mRNA阳性（95%CI： 1.251~2.049）是宫颈癌的高危因素（P<0.05）。年龄（35~65岁）（95%CI： 1.134~1.436）、孕次≥3次（95% CI： 1.346~2.472）、性伴侣≥3个（95% CI： 1.526~2.386）、阴道分泌物异常（95%CI： 1.021~1.778）及HPVE6/E7 mRNA阳性（95% CI： 1.216~1.920）是高危型HPV的危险因素（P<0.05）。ROC分析显示孕次、初次性生活时间、SCC及HPVE6/E7 mRNA多项联合检测宫颈癌的AUC为0.826,高于单项检测（P<0.05）。年龄、孕次、性伴侣、阴道分泌物及HPVE6/E7 mRNA联合检测高危型HPV的AUC为0.880,高于单项检测（P<0.05）。结论 HPVE6/E7 mRNA阳性是宫颈癌和高危型HPV共同的独立影响因素,基于HPVE6/E7 mRNA的多项联合检测较单项检测能显著提高检测宫颈癌与HPV分型的准确性。     

宫颈组织人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA ATG-12 Tie-1 表达情况及与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的 分析宫颈组织人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白12(ATG12)、酪氨酸激酶受体1(Tie-1)表达情况,及与子宫颈鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法 将2017年1月至2020年12月在南阳市中心医院保存宫颈活检组织或手术切除宫颈组织的228例患者按2014年WHO女性下生殖道肿瘤分类标准分组,分别纳入慢性宫颈炎组(n=34)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组(n=20)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组(n=55)、宫颈鳞癌(CSCC)组(n=119)。通过分支DNA杂交实验(bDNA)法检测宫颈组织HPVE6/E7 mRNA表达情况,利用免疫组化法检测宫颈组织ATG12、Tie-1表达情况,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析HPV E6/E7mRNA、ATG-12、Tie-1表达情况对HSIL+(HSIL、CSCC)的筛查价值。结果 HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于慢性宫颈炎组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于慢性宫颈炎组,差异均有统计学意义(P<0.05);LSIL组与慢性宫颈炎组,差异无统计学意义(P<0.05);HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于LSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于LSIL组(P<0.05),CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于HSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于HSIL组(P<0.05);ROC曲线显示,单一HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1筛查HSIL+时,Tie-1阴性的曲线下面积(AUC)最大,筛查灵敏度为78.16%,特异度为83.33%,3者联合筛查HSIL+的AUC值上升至0.856,灵敏度、特异度分别为89.66%、81.48%,高于HPV-E6/E7 mRNA阳性、ATG-12阴性、Tie-1阴性筛查的AUC值(P<0.05)。结论 不同SIL病理分级的宫颈组织HPVE6/E7mRNA、ATG12、Tie-1阳性表达率存在差异,较单纯HPVE6/E7mRNA筛查HSIL+,联合ATG12或Tie-1检测可提升筛查特异度。     

高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈人乳头瘤病毒阳性人群中的分流价值

目的 探讨高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)E6/E7mRNA检测在宫颈人乳头瘤病毒DNA阳性人群分流管理中的临床应用价值。方法 2014年1月~2015年7月因宫颈疾病在温州医科大学第三临床学院妇科门诊就诊的宫颈HPV-DNA阳性患者共970例,随机选取336例,均行HPVE6/E7mRNA及宫颈细胞学(TCT)检测,并追踪其病理学结果 。分析HPVE6/E7mRNA拷贝数与病理分级及宫颈细胞学结果 的关系,预测其对CINⅡ+的诊断价值。结果 鳞癌(squamouscell cancer,SCC)组拷贝数最高,无上皮内病变或恶性病变(negative for intraepithelial ledion or malignancy,NILM)组拷贝数最低,宫颈癌组HPVE6/E7mRNA阳性率及拷贝数最高,宫颈炎性改变组阳性率及拷贝数最低。不同细胞学诊断级别间HPVE6/E7mRNA水平比较,细胞学异常组(包括atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS,low-grade squamous intraepithelial lesion LISL,high-grade squamous intraepithelial lesions HISL,SCC)的表达水平高于NILM组,差异有统计学意义(F=28.99,P<0.01),不同宫颈组织病变程度级别间HPVE6/E7mRNA水平比较,CINⅡ+(histological dysplasia or cancer)的表达水平高于CINⅡ-,差异有统计学意义(F=40.154,P<0.01)。Spearman等级相关提示宫颈细胞学诊断级别及宫颈病理级别同HPVE6/E7mRNA拷贝数呈正相关,相关系数分别为(r=0.408,P<0.01;r=0.699,P<0.01)。结论 随着宫颈病变程度的加重,HPVE6/E7mRNA拷贝数逐渐增加,对宫颈HPV-DNA阳性患者的分流有一定的意义,对宫颈癌有一定的筛查价值。     

高危型HPV E6/E7 mRNA检测在ASC-US分流中的诊断价值

目的 探讨高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus,HR-HPV）E6/E7 mRNA检测在无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US）分流中的诊断价值。方法 对320例ASC-US患者进行HR-HPV E6/E7 mRNA和HR-HPVDNA检测,同时行阴道镜检查和宫颈活检,结合病理学诊断资料进行统计学分析。结果 HR-HPV E6/E7 mRNA在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌中的阳性率与HR-HPV DNA比较,差异有统计学意义（P<0.05）;CINⅡ+级和CINⅢ+级的HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率分别高于CINⅡ-级和CINⅢ-级,差异均有统计学意义（P均<0.05）。HR-HPV E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA检测CINⅡ+级和CINⅢ+级的敏感度、阳性预测值、阴性预测值比较,差异无统计学意义（P均>0.05）;两者特异性比较,差异有统计学意义（P均<0.05）;利用受试者工作特征（ROC）曲线,HR-HPV E6/E7 mRNA检测诊断CINⅡ+级和CINⅢ+级的效能比HR-HPV DNA更佳,差异均有统计学意义（P均=0.000）。<30岁组的HR-HPV DNA阳性率明显高于≥30岁组,差异有统计学意义（P<0.01）;两个年龄组的HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HR-HPV E6/E7 mRNA检测可作为ASC-US患者是否需要阴道镜转诊的更确切有效的指标,其特异性和诊断价值更佳。     

特异性siRNA抑制HPV16 E7基因表达的实验研究

目的筛选针对HPV16 E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT E7 细胞中HPV16 E7 mRNA及细胞表面HLA Ⅰ类分子表达的影响。方法采用化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT E7细胞,采用实时荧光定量PCR（RT PCR）检测HPV16 E7 mRNA的表达,采用流式细胞术（FCM）检测细胞表面HLA Ⅰ类分子的表达。结果3条siRNA均能有效抑制HaCaT E7细胞中HPV16 E7的转录表达,以siRNA2作用效果最明显,抑制率达75%,细胞膜表面HLA Ⅰ类分子的表达明显上调,平均荧光强度(MFI)为130.18±1.07,高于空转染对照组（100.32±3.01）和非特异性siRNA对照组（100.82±2.87）。 结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT E7细胞中E7 mRNA的表达,同时使细胞表面HLA Ⅰ类分子表达上调。     

宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型方法的建立

【立论依据】 高危型HPV在感染过程中产生的病毒源性癌蛋白E6、E7在宿主细胞中呈过度表达,是致宫颈癌的关键因素。已经证实,病毒基因组整合到宿主染色体是HPV致癌的重要因素。HPV DNA的整合不但改变整合位点及临近宿主基因的表达,而且可使HPV衣壳蛋白基因(L1和L2)片段缺失,这严重限制了目前临床上使用的基于L1基因序列的HPV检测及分型。本研究拟选择宫颈癌组织高表达的E6、E7基因序列,设计特异性探针及引物,优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,可快速对宫颈癌组织中高危型HPV进行检测和分型。 【设计思路】 设计HPV不同型别E6/E7特异性探针及引物,优化PCR条件,扩增宫颈肿瘤组织标本中高危型HPV E6/E7基因,结合测序,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,对宫颈癌组织高危型HPV进行检测和分型,并与目前临床上广泛使用的检测方法比较,验证该方法的敏感性和特异性。 【实验内容】 收集低度上皮内瘤变(LSIL)、高度上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌组织样本等不同类型的宫颈肿瘤组织标本,抽提DNA;根据高危型HPV早期基因 E6/E7基因序列,在同源性分析的基础上,设计HPV不同型别的E6/E7特异性探针及引物, PCR扩增宫颈肿瘤组织标本DNA,通过基因测序验证PCR扩增的特异性;进一步优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,检测宫颈肿瘤组织标本中HPV感染及型别,并与目前临床上使用的检测试剂盒比较,分析检测的灵敏性和特异性。 【材料】 LSIL组织样本、HSIL组织样本和宫颈癌组织样本各30例; HPV16+Siha细胞、HPV18+Hela细胞;不同型别HPV的E6/E7特异性探针及引物;高保真PCR酶及反应体系;琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳检测系统等。 【可行性】 本项目立论依据充分,标本来源丰富,前期预实验已运用此方法对高危型HPV16/18完成初步分型。 【创新性】 迄今尚无相关研究报道。本检测方法的建立为我国高危型HPV流行检测及宫颈癌疫苗的推广奠定基础。     

高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈CIN2+病变筛查中的应用价值

目的探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV) E6/E7 mRNA在子宫颈上皮内瘤变中度及以上(CIN2+级)病变筛查中的临床应用价值。方法选取2016年6月至2017年6月在北京市垂杨柳医院因接触性阴道出血或疑似宫颈病变妇科门诊就诊的患者307例,均行液基薄层细胞检查(TCT)、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的检测,并行阴道镜检查及活检。以病理结果为金标准,将病检结果为高级别鳞状上皮内病变(HSIL,包括CIN2和CIN3)或宫颈鳞癌或宫颈腺癌的71例患者作为观察组,记为CIN2+;将病检结果正常和低级别鳞状上皮内病变(LSIL,包括CIN1)的236例患者作为对照组,记为CIN2-。分析TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的灵敏度和特异度差异。结果 HPV E6/E7mRNA及HPV DNA对CIN2+诊断的特异度分别为79. 66%及19. 49%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7mRNA联合TCT及HPV DNA联合TCT检测对CIN2+诊断的特异度分别为82. 63%及35. 17%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在筛查CIN2+的ROC曲线下面积分别为0. 8420和0. 5693,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 HPV E6/E7 mRNA较HPV DNA检测筛查宫颈CIN2+的病变效果更好,HPVE6/E-7mRNA联合TCT检测能够提高对CIN2+的病变筛查的特异性。     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

利用反义技术抑制人乳头瘤病毒18 E6/E7的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响

目的 构建人乳头瘤病毒（HPV）18型E6／E7反义荧光真核表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响。方法 以PCR法扩增HPV18型E6／E7区716bp片段并反向克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pEGFP-HPV18E6E7as（EGFP-18AS）并转染人宫颈癌HeLa细胞。利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western印迹技术检测转染后E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的变化;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测转染后细胞的的增殖活性;用流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率;荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学改变。结果 转染EGFP-18AS重组体后,HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA表达和蛋白合成均明显下调;细胞增殖受到抑制;流式显示细胞G1期明显阻滞;同时在荧光显微镜下经Hoechst染色凋亡细胞出现染色质凝集、边集、碎裂等形态学改变。结论 重组质粒pEGFP—HPV18E6E7as能有效地抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖,诱导其凋亡,证明了反义RNA技术的有效性,为宫颈癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对Hela细胞增殖及CDH1、HPV18E6mRNA表达的影响

目的:探讨DNA去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对宫颈癌Hela细胞株增殖及抑癌基因CDH1和HPV18E6 mRNA的表达水平的影响。方法:不同浓度5-Aza-CdR干预Hela细胞株24h以后,四唑氮蓝法(MTT)检测其对Hela细胞增殖的影响,半定量RT-PCR检测CDH1及HPV18E6 mRNA表达的改变。结果:与对照组(DMSO)相比,5-Aza-CdR能显著抑制Hela细胞增值,且呈量-效性。5-Aza-CdR能显著抑制Hela细胞CDH1 mRNA的表达水平(P<0.05),而对HPV18E6 mRNA表达水平无明显影响(P>0.05)。结论:5-Aza-CdR能抑制Hela细胞增殖,其作用可能是通过上调宫颈癌抑癌基因CDH1的表达实现,有望为宫颈癌的治疗提供新的治疗思路。     

HPV E6/E7 mRNA与YAP在宫颈癌中的表达与相关性研究

目的:研究宫颈病变中HPV E6/E7 mRNA与Yes相关蛋白（YAP）的表达情况及临床意义,探讨两者之间的相关性。方法: 应用支链DNA（b-DNA）技术检测36例正常宫颈组织（正常组）、45例宫颈上皮内瘤变(CIN) Ⅱ-Ⅲ级（CIN组）、43例宫颈癌（宫颈癌组）的宫颈脱落细胞标本中HPV E6/E7 mRNA的表达情况,免疫组化方法（IHC）检测上述各组患者宫颈组织石蜡包埋标本中YAP的表达情况。结果:HPV E6/E7 mRNA及YAP阳性表达率在正常组分别为16.67%、11.11%,在CIN组分别为82.22%、84.44%,在宫颈癌组分别为88.37%、90.70%,3组HPV E6/E7 mRNA及YAP阳性表达率均逐渐升高,且差异均具有统计学意义（P<0.05）。YAP在宫颈癌有淋巴结转移组中的表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）,而与宫颈癌的临床分期、组织学分级及组织学类型无关（P>0.05)。HPV E6/E7 mRNA与YAP的表达呈正相关（r=0.383,P<0.05）。结论:HPV E6/E7 mRNA与YAP的检出率随病理级别的升高呈增强趋势,且两者具有相关性。因此,HPV E6/E7 mRNA与YAP的联合检查,可以提高宫颈病变的诊断率并能够预测癌前病变的进展。     

HPV E6/E7 mRNA检查对宫颈细胞学ASCUS的分流价值

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检查在宫颈细胞学检查结果为意义不明确的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)患者中的分流价值.方法 收集2019年8月-2020年8月就诊于蚌埠医学院第一附属医院妇科,液基薄层细胞学(TCT)为ASCUS的患者,行(HPV)DNA检查、(HPV)E6/E7 mRNA检查,阳...     

高危人乳头瘤病毒DNA及其E6／E7mRNA对宫颈病变的影响

目的：分析不同宫颈病变患者高危HPV DNA及其E6/E7mRNA在不同宫颈病变中的阳性率有无差异,评估mRNA拷贝数大小与病变等级的关系。方法采用聚合酶链反应-反向点杂交技术、原位杂交技术对101例宫颈脱落细胞标本（炎症组29例,低级别组29例,高级别组43例）进行HPV分型及高危 HPV E6/E7 mRNA拷贝数的检测。结果高危HPV DNA及其E6/E7mRNA在炎症组与低级别组、炎症组与高级别组中的阳性率均具有统计学差异（均P＜0.05）,其拷贝数的均值随着宫颈病变等级的上升而明显增加。结论高危HPV的感染及其E6/E7mRNA的表达与宫颈病变密切相关,E6/E7 mRNA拷贝数的大小影响宫颈病变的程度。两者结合将更有利于对宫颈病变的综合评估。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。