利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒pX335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞,7天后,再用另一对转染HeLa细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因,为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。     

木香饮片和新鲜药材DNA片段的克隆及同源性比较分析

目的 对木香的饮片和新鲜药材进行DNA片段的比对分析,为木香的鉴定提供研究思路。方法 选取木香饮片和新鲜药材,利用CTAB法提取其基因组总DNA,再进行PCR扩增筛选随机引物,找出能同时扩增饮片及新鲜药材基因组总DNA的随机引物,对饮片及新鲜药材基因组总DNA扩增产生的一致性条带进行克隆,得到阳性菌落,经转化子鉴定后测序。对所测序列进行生物信息学分析和同源性比较。结果 木香饮片与新鲜药材长度均为794 bp的克隆片段序列相似度达99.75%,长度为1 116 bp的克隆片段的核苷酸水平比对及氨基酸水平比对的相似度均为100%。结论 采用分子生物学手段能对木香饮片和新鲜药材进行鉴定。     

肝细胞癌组织中乙肝病毒HBx-d382突变体S区基因分析

目的分析肝细胞癌组织中乙肝病毒HBx-d382突变体S基因和前S基因,了解其变异情况。方法采用巢式PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法对16份肝细胞癌组织中乙肝病毒S基因和前S基因进行扩增和分析。选择HBxd382突变体S基因和前S基因目的片段进行回收、纯化、克隆和测序,并与HBV参考序列进行比对。结果16份肝癌组织中有9份存在HBx-d382突变体,HBx-d382突变体肝癌组织S基因和前S基因检出率分别为11.11%(1/9)、44.44%(4/9),且50.00%的肝癌组织前S基因PCR扩增产物出现了多条带。HBx-d382突变体S基因和前S基因目的片段与HBV参考序列(AF282917)比对,一致性介于98.08%至98.97%。结论 HBx-d382突变体肝癌组织中部分检出了S基因和前S基因,前S基因比S基因更容易发生突变。     

1.1倍全长HBV基因组克隆转染细胞系的建立

目的构建pneo-CH9/3091真核表达质粒,并建立其稳定表达的HepG2细胞系。方法质粒pCH9/3091包含HBV1.1倍体和CMV启动子,将PCR扩增出的带有新霉素(neo)抗性的基因片段插入pCH9/3091构建成重组质粒pneo-CH9/3091。重组质粒经酶切,测序验证正确后,通过脂质体介导转入人肝癌细胞HepG2。G418筛选后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所得单克隆细胞培养上清液的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),PCR检测细胞上清液的病毒颗粒,Western blot检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达,以及Southern blot检测细胞内核心颗粒HBV DNA的复制情况。结果有3株细胞系培养上清HBsAg和HBeAg检测呈现阳性,且HBV C区片段可通过PCR扩增出来,West-ern bot结果提示只有细胞株HepG2-H7可以表达HBV核心蛋白。Southern blot结果说明此细胞株基因组中有HBV基因组的稳定整合,并且能在细胞内检测出HBV DNA复制中间体。结论成功构建1株HBV稳定整合细胞株HepG2-H7,能持续产生HBV病毒颗粒。     

应用AFLP法检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传差异

目的：应用AFLP技术检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传改变，以期发现与肿瘤转移相关的DNA片段或基因。方法：肿瘤组织基因组DNA经限制性内切酶酶切，连接特异性接头，采用25对与接头相识别的引物进行扩增，扩增产物经含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶电泳，紫外透视仪分析，照相，回收差异片段，克隆测序，结果：25对引物均扩增出清晰条带，21对引物扩增结果显示高低转移性肝癌无差异，4对引物扩增结果显示二者之间有差异，表现为扩增带的有无，4条回收片段中的1条片段克隆成功并测序，结论：AFLP技术适用于肿瘤易感基因的筛选，小鼠肝癌的转移可能与基因组不稳定性有关，所得差异片段是否与转移相关有待进一步鉴定。     

毛黄堇和石生黄堇的ITS序列差异分析

目的 从分子水平鉴别濒危药用植物毛黄堇和石生黄堇的差异。方法 分别从毛黄堇和石生黄堇的叶片中提取DNA,以核基因组通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后对PCR产物采用直接测序法进行测序。结果 获得ITS及5.8 S rDNA完全序列,分别为毛黄堇561 bp、石生黄堇552 bp;二者的ITS序列差异呈显著性,其中ITS1差异性达16.28%,ITS2差异性达21.21%。结论 ITS序列可有效地鉴别毛黄堇和石生黄堇,并可广泛应用于中药材的鉴别。     

原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒基因整合的突变分析

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)整合序列中基本核心区突变与乙肝病毒相关肝癌发生的相关性。方法应用Alu-PCR和基于接头的LM-PCR方法扩增40对乙肝相关性肝癌组织和配对癌旁组织中整合的HBV序列,PCR产物纯化后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,测序结果使用Pub Med BLAST软件和Bio Edit软件进行分析。结果 65.0%的肝癌组织检测到整合HBV病毒序列(26/40),共检出37个不同的HBV整合序列。67.5%的癌旁组织中检测到整合HBV病毒(27/40),共检出68个不同的整合序列。平均每例肝癌组织中HBV整合序列检出数为1.42个,而癌旁组织为2.52个,癌组织低于癌旁组织。整合HBV序列发生A1762T/G1764A双突变在肝癌中的检出率高于癌旁组织,差异无统计学意义。结论 HBV感染相关肝癌组织及癌旁组织中都检测到整合HBV序列,再次表明整合是肝癌发生中的一个早期事件;而肝癌组织中整合HBV序列有更高的A1762T/G1764A突变检出率,从一个新的侧面表明这些突变在病毒的致癌过程中具有重要作用。     

DNA条形码序列对9种蒿属药用植物的鉴定

目的 采用DNA条形码序列对9种常见的蒿属药用植物进行鉴定,为常见蒿属药用植物的鉴定提供分子依据。方法 对9种常见蒿属药用植物的4条候选DNA条形码序列（ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH）进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,应用BLAST1、Distance方法来评估各序列的鉴定效率。此外,基于MEGA5分析9种常见蒿属药用植物ITS2序列种间K2P遗传距离并构建NJ树。结果 除matK外,其余3条片段的PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对9种蒿属药用植物的物种水平鉴定成功率最高,为100%,而psbA-trnH、rbcL、matK、matK＋rbcL的鉴定成功率（BLAST1法）分别为83.3%、66.7%、54.5%、75%。通过ITS2序列的种间K2P遗传距离及NJ树均能将不同物种全部区分。结论 ITS2序列可以作为鉴定蒿属药用植物的潜在条形码。     

应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白

目的 用T7噬菌体展示技术（phage-displayed technique, PDT）筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1, sLRIG1）相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制找到突破点。方法 利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统（baculovirus expression system, BEVS）获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序。结果 经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1.85×10⁶PFU,趋于稳定。回收的DNA片段多在250~750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,最终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关。结论 通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础。     

运用PCR直接测定基因组DNA序列法检出一种中国人中罕见的β-地中海贫血基因突变(简报)

借助PCR(聚合酶链反应)技术可直接测定人基因组DNA中特定基因片段的序列.用双脱氧末端终止法测定单链DNA(ss-DNA)序列比测定双链DNA(ds-DNA)序列效果好,故本实验建立用PCR产生ss-DNA,进而测定其序列以便检测β地中海贫血基因突变的方法.扩增的β珠蛋白基因片段从启动子5’端到第二内含子长615bp.所用引物序列:Ⅰ.5’GCCAAGGACAGGTACGGCT GT CATC 3’;Ⅱ.5’TGC AGC TTG TCA CAG TGC AGC TCA CT 3’.利用PCR产生ss-DNA的策略有两个.一是用引物Ⅰ和Ⅱ扩增出ds-DNA,经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离.回收特异的ds-DNA;再以后者     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

A simple method for purification of genomic DNA from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier

Objective： To establish a method of genomic DNA extraction from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier. Methods： Two crucial conditions （sodium chloride concentration and amount of the magnetic particles） were optimized and 8 different human whole blood samples were used to purify genomic DNA under the optimal condition. Then agarose gel electrophoresis and polymerase cbain reaction （PCR） were performed. Results： The optimal binding condition was 1.5 mol/L NaC1/10% PEG, and the optimal amount of Fe3O4/Au composite particles was 600μg. The yields of the genomic DNA from 100μl of different whole blood samples were 2-5 μg, and the ratio of A260/A280 was in the range of 1.70-1.90. The size of genomic DNA was about 23 kb and the PCR was valid. Conclusion： The purification system using Fe3O4/Au composite microparticles has advantages in high yield, high purity, ease of operating, time saving and avoiding centrifugation. The purified sample was found to function satisfactorily in PCR amplification.     

灵芪胶囊含药血清对K562白血病细胞的诱导凋亡作用

[目的]观察灵芪胶囊含药血清在体外对K562白血病细胞凋亡的影响。[方法]采用血清药理学方法制备灵芪胶囊含药血清,以不同浓度的含药血清处理体外培养的K562白血病细胞,采用流式细胞仪(FCM)及DNA片段凝胶电泳观察和检测细胞凋亡情况。[结果]不同浓度灵芪胶囊含药血清能够诱导K562细胞的凋亡,且凋亡率随着剂量的增加而增大,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01);DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见典型的DNA梯形带形成。[结论]灵芪胶囊含药血清具有诱导细胞凋亡的作用,其作用强度与时间—浓度呈正相关。灵芪胶囊含药血清对K562细胞发生细胞毒作用可能与诱导K562细胞凋亡有关。     

PCR技术用于检测肝细胞癌石蜡包埋肝组织中的HBV DNA

用多聚酶链反应(PCR)技术检测了16例肝细胞性肝癌(HCC)患者癌灶和癌旁双份组织石蜡包埋标本中的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)。以C基因引物扩增HBV-DNA,32份标本中检出率71.87％。以新鲜冷冻肝标本作对照检出率81.25％,二者相比无显著性差别(X~=0.57,P>0.05)。以质粒提取HBV-DNA作灵敏度测定,PCR-EB可达10fg,PCR-SBH可达lag。应用非放射性的地高辛素标记探针作杂交灵敏度达~32P标记探针的水平。     

人乳头瘤病毒DNA在宫颈癌组织中的整合状态

人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈癌组织中是否整合,各家报道不一。多数研究证实良性病变中的HPV以游离状态存在,而恶性病变中的HPV DNA则已与宿主细胞基因整合。本实验从HPV 16杂交阳性病例中随机抽取5例标本。应用四种方法研究HPV 16在宫颈癌组织中的整合状态,旨在阐述HPV的致癌机理提供实验依据.     

肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的研究

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞染色体上的整合规律及其在肝癌形成中的作用.方法以蛋白酶消化/酚抽提法,自40例乙肝相关性肝癌标本中抽提组织DNA.以肝癌组织DNA为模板,HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,多聚酶链反应法（PCR）扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,所获结果经NCBI（national center for biotechnology information）BLAST及MapViewer检索确定HBV整合在染色体上的精确位置.结果在40例乙肝表面抗原阳性的肝癌组织中,有34例（85%）存在HBV整合现象.每份标本中的病毒整合拷贝数为1～5个不等,因此共获得了68个病毒整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任何长度,并不集中于通常认为的HBV DR1和DR2区,但在96%（65/68）的整合中,X基因均以截短形式插入宿主细胞DNA;从宿主基因分析,HBV偏好插入于基因的内含子和上游调控区,未见外显子中的插入.这些基因80%已被报道与肿瘤有关,它们的产物大多与细胞基本生存和死亡密切相关,可在各个细胞调控环节上促进肿瘤生成.十分有意义的是,在总共26个基因中即有3个基因（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4,Gprotein alpha transducing activity polypeptide 1和fibronectin 1）发现被HBV重复整合.结论HBV在肝癌细胞染色体上的整合并不呈均衡分布,病毒对宿主细胞的＂插入诱变＂及整合子中持续表达的＂截短型X蛋白＂可能在病毒的致癌过程中起重要作用.     

韶关地区乙型肝炎患者HBV亚基因型的分布

目的 探讨韶关地区乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况. 方法 应用PCR法结合琼脂糖电泳方法对378例乙型肝炎患者进行基因分型和检测,根据PCR产物大小直接判定HBV基因型,应用PCR扩增全S基因序列-DNA测序-生物信息学分析方法确定部分样品的亚基因型,并探讨前S区编码情况. 结果 在378例乙型肝炎患者中B基因型263例占69.6％,C基因型113例占29.9％,BC混合型2例占0.5％.B基因型中HBeAg阳性患者占66.5％,抗-HBe阳性占33.5％. 结论 广东韶关地区乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主,C型次之,少量BC混合型,HBV复制强弱与病毒基因型无关.     

一种新的同时定量检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA的检测方法

目的 设计并建立一种新的能够同时测定核酸提取物中乙型肝炎病毒（HBV）前基因组RNA（pgRNA）和DNA的检测方法。方法 建立检测HBV pgRNA和DNA的探针法双重荧光定量PCR体系,通过DNA凝胶电泳、定量PCR等实验考察该检测体系的特异性和灵敏度,验证以该方法测定HepG2.2.15细胞及其培养上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及准确度。结果 建立的探针法双重荧光定量PCR体系具有较好的特异性和灵敏度,测定不同稀释倍数的细胞培养上清时,在稀释倍数和测定结果间具有较好的相关性。但该方法更适用于测定细胞培养上清中的HBV pgRNA和DNA,而不适用于测定细胞样本。结论 本实验建立的方法能够避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不准的问题,并且在一管PCR反应中同时实现了HBV pgRNA和DNA的双重检测,极大提高了检测效率,具有潜在的临床应用价值。