全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达?方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因?HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过Cellfectin Ⅱ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达?分别用SDS-PAGE?Western blot?血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定?结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000?血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集?质谱分析鉴定该重组蛋白为HA 蛋白?结论:重组HA 蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础?     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析

目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性?方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体?以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000?纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础?     

人类偏肺病毒F基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人类偏肺病毒融合蛋白(F)基因的真核表达质粒,并在昆虫细胞sf-9中表达.方法:采用RT-PCR法扩增人类偏肺病毒A亚型CAN97-83 F基因的全长序列,将其插入供体质粒pFastBacHT载体多克隆位点区,经酶切鉴定后转化大肠杆菌DH10bac.供体质粒与受体杆粒(Bacmid)发生位点特异性转座获得重组的杆粒.采用脂质体将重组杆粒转染进昆虫细胞sf-9,包装获得感染性杆状病毒.用此病毒感染sf-9细胞并表达蛋白,经6×His树脂纯化后用免疫印迹法验证表达蛋白.结果:PCR及序列分析证实所获得的重组杆粒包含hMPV全长F基因序列,被重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf-9显示典型细胞病变.采用抗6×His单克隆抗体为一抗,免疫印迹法检测到分子量约70ku的较单一的蛋白条带,证实F蛋白表达成功.结论:杆状病毒是一高通量、目标蛋白抗原性保存完好的表达系统.采用这一系统成功表达的hMPV F蛋白,将为我国hMPV血清流行病学和免疫发病机理研究奠定基础.     

狂犬病病毒糖蛋白在酿酒酵母中的分泌表达

目的 使狂犬病病毒糖蛋白在酿酒酵母中获得分泌表达,为制备口服狂犬病疫苗奠定基础.方法 克隆狂犬病病毒糖蛋白基因,与菊粉酶信号肽序列连接为融合基因InG,该融合基因克隆至pYes2载体Gal1启动子下游,构建成诱导分泌表达载体pYes2-InU-G,该重组载体转化酿酒酵母筛选阳性克隆,阳性重组子经半乳糖诱导12 h后,收集上清进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定.结果 RT-PCR和Western-blot鉴定显示狂犬病病毒糖蛋白已获得分泌表达,并且具有良好的抗原性.结论 CVS24病毒株的糖蛋白在酿酒酵母中获得分泌表达且具有良好的抗原性,为进一步研究重组酵母能否在消化道中存活并继续进行分泌表达提供了研究条件.     

M2e-HBC融合蛋白的真核表达

目的:构建以乙肝病毒核心蛋白(HBC)为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行真核表达。方法:利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HBC相连。经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HBC杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HBC的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达。结果:构建了以HBC为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到M2e-HBC融合蛋白真核表达。结论:成功构建了HBC与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

Carboxyl terminus truncated human papillomavirus type 58 L1 protein maintains its bioactivity and ability to form virus-like particles

Summary: To prepare carboxyl terminus truncated human papillomavirus type 58 L1 ( HPV581.1 )protein and evaluate its ability to form virus-like particles, the baculovirus and Sf-9 insect cells was used to express HPV581.1 protein, and pFastBac-Htb containing HPV58L1 gene sequence of carboxyl terminus truncation was generated. Then Sf-9 cells were infected with recombinant baculovirus. After being cultured, the post-infected cells expressing - HPV58L1 protein were harvested and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The ProBond^TM purification system was used for protein purification. The bio-activity of purified protein was identified by mouse erythrocyte hemagglutination assay, and the VLP formation was examined with transmission electron microscope.Our results showed that the recombinant baculovirus was generated and the Sf-9 cells was infected with the recombinant baculovirus, and after collecting, total cellular proteins were extracted. Truncared HPV581.1 protein with MW 58KD was revealed by SDS-PAGE and confirmed by Western blot. The purified L1 proteins under native condition could cause mouse erythrocytes to agglutinate and form VLP. It is concluded that HPV58L1 protein with carboxyl terminus truncation could be efficiently expressed. In baculovirus Sf-9 cells expression system, the purified protein could self-assemble into virions in vitro, and induce agglutination of mouse erythrocytes, indicating that carboxyl terminus truncation does not interfere with the bioactivity of HPV58L1 protein.     

登革Ⅱ型病毒Tr1751株E蛋白基因的克隆与表达载体的构建

目的从登革Ⅱ病毒Tr1751株中克隆表达E蛋白的基因,构建了真核表达质粒,为其后继的关于结构和功能的研究提供了条件。方法合成DEN2(Tr1751株)的E蛋白基因引物,通过RT-PCR的方法扩增含有信号肽E蛋白的基因片段,并与真核载体p IRES-hr GFP-1α连接,得到重组的质粒p IRES-hr GFP-1α-E,再用PCR、双酶切和测序的方法进行鉴定。结果 RT-PCR得到的为1 527bp的E蛋白基因片段,酶切鉴定和测序显示重组的质粒含有DEN2病毒中的E蛋白的基因。用重组质粒测序后与Gen Bank中的已知Tr1751株进行相似性比对,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性均为99%。结论成功的构建出含有全长DEN2的E蛋白基因的真核质粒,为登革病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。     

人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

目的:构建人CCR5基因的真核表达质粒并对其进行功能鉴定.方法:PCR扩增人CCR5基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1内,构建含人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5.使用RT-PCR、流式细胞术和HIV假病毒感染实验的方法,鉴定CCR5在真核细胞中的表达和功能.结果:克隆的人CCR5基因与GenBank中已登记的基因序列100%同源.瞬时转染真核细胞后,RT-PCR在预期的位置检测出目的条带,流式细胞术检测到约25.6%的细胞表达CCR5蛋白,且该蛋白能介导HIV假病毒的感染.结论:成功构建了含人CCR5基因的真核表达质粒.     

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的：在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（gD2）胞外区基因,检测其免疫原性。方法：以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒（P4）,通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠（gD2组）,以PBS作为阴性对照（PBS组）,ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果：PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×10⁹ pfu·mL^-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH...     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导