两种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激下口腔上皮细胞ICAM-1的表达

目的比较2种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P．gingivalis）刺激下口腔上皮细胞ICAM-1的表达水平。方法实验组用P．gingivalis ATCC 33277（Ⅰ型菌毛组）,W83（Ⅳ型菌毛组）,47A-1（Ⅳ型菌毛组）分别与KB细胞（ATCC CCL17）共同孵育24h;对照组为未受P.gingivalis刺激的KB细胞。分别在1h、3h、6h和24h收集细胞,运用流式细胞仪检测KB细胞膜上ICAM-1的动态表达。结果P．gingivalis刺激细胞后3h、6h和24h,实验组ICAM-1的表达水平均高于对照组;2种fimA基因型P．gingivalis调节KB细胞表达ICAM-1的方式相似,Ⅳ型菌毛组的调节作用强于Ⅰ型菌毛组。结论P.gingivalis上调口腔上皮细胞表达ICAM-1的水平与其fimA基因型相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。     

P. gingivalis感染对血管内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)ATCC 33277和W83感染对血管内皮细胞血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)转录和翻译的影响.方法:建立体外P. gingivalis感染血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测VCAM-1基因表达;蛋白质印迹技术检测VCAM-1膜蛋白表达变化.采用SAS 8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析.结果:P. gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1mRNA表达(与对照组比较,P<0.05),8 h达高峰,24 h有持续的高表达;P.gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1蛋白表达(P<0.05),8 h有持续的高表达,24 h表达到达高峰(P<0.05).P.gingivalis W83诱导VCAM-1表达的能力强于ATCC 33277(P<0.05).结论:P.gingivalis感染可引起血管内皮细胞VCAM-1高表达,提示P.gingivalis可能在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要的意义.     

牙龈卟啉单胞菌唾液酸酶基因突变株黏附与侵入KB细胞能力研究

目的    研究PG0352基因缺失对牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）黏附和侵入人口腔上皮癌KB细胞能力的影响。方法    本研究于2014年7—12月在中国医科大学口腔医学院中心实验室完成。实验组：将P. gingivalis W83菌株（W83菌株组）和PG0352基因突变株（PG0352突变株组）分别以100∶1的比例与KB细胞共培养2 h,制备P. gingivalis与KB细胞的黏附和侵入模型;对照组：单纯KB细胞培养。透射电镜观察KB细胞表面及细胞内是否有P. gingivalis存在;用PBS清除未黏附于KB细胞的细菌,裂解细胞后涂板检测P. gingivalis黏附和侵入KB细胞情况,抗生素保护法检测P. gingivalis侵入KB细胞情况。结果    透射电镜结果发现,W83菌株组和PG0352突变株组KB细胞内均有细菌侵入;通过涂板后菌落计数发现P. gingivalis W83菌株和PG0352基因突变株对KB细胞的黏附率分别为（15.559 ± 2.020）%和（9.309 ± 1.750）%,侵入率分别为（0.651 ± 0.287）%和（1.517 ± 0.233）%,两者差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论    P. gingivalis W83菌株和PG0352基因突变株均能够黏附和侵入KB细胞;与W83菌株相比,PG0352基因突变株黏附上皮细胞的能力较弱而侵入能力较强。     

核因子Kappa B与肿瘤坏死因子α在口腔扁平苔藓中的相关性

目的：研究核因子KappaB（NF—KB）和肿瘤坏死因子α（TNF—α）在口腔扁平苔藓（OLP）中的相关性,及其两种因子的表达与OLP临床特征之间的联系。方法：30例OLP患者根据其临床表现分为萎缩-糜烂型及斑纹型,采用免疫组化方法研究OLP两种临床类型NF—KBp65及TNF-α的表达,并计算阳性细胞百分率。选取10例正常组织作为对照。结果：NF—KBp65阳性表达位于OLP上皮基底层及临近细胞的胞核内,而正常组织未见胞核着色。TNF-α阳性表达位于OLP上皮基底层细胞的胞质内,正常组织中仅有散在阳性表达。NF—KBp65和TNF—α的表达在不同临床类型、年龄及病损部位中有显著性差异（P〈0．05）,但与性别无关（P〉0．05）。NF—KBp65的胞核着色与TNF-α的高表达呈正相关（r=0．676,P〈0．01）。结论：OLP中NF—KB被激活与TNF-α的高表达密切相关。在NF—KB和TNF-α之间可能存在一个正反馈调节环,这种正反馈的机制可能加重了OLP的炎性反应,同时也可能保护了上皮细胞,避免了过多的凋亡。     

染料木素通过人牙周膜细胞上的GPR30调控IL-1β介导的MAPKs通路

牙周膜细胞（PDLC）对牙周组织健康、牙周炎症和组织再生起关键性作用。牙周炎时,牙周组织的破坏是由宿主组织产生的炎症细胞因子介导的,包括白细胞介素1B（IL—lβ）。本实验旨在研究在人PDLC中G蛋白偶联受体30（GPR30,又称为G蛋白偶联雌激素受体1）的表达以及IL-1β对GPR30的调节作用。IL-1β诱导GPP30在人PDLC中进行表达,并激活多种信号通路,包括MAPKs、NF—KB和P13K通路。与之相反,染料木素是一种雌激素受体配体,它能延迟IL-1β对MAPKs通路的激活作用。另外,G15是一种GPRS0的特异性拮抗剂,可通过抑制GPR30而消除这种延迟效应。因此,染料木素在经GPR30诱导的MAPKs通路激活过程中起调节作用,GPR30提供了PDLC中可受类固醇激素调控的新研究靶点。     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖诱导小鼠成骨细胞表达白细胞介素-23

目的：探讨牙髓卟啉单胞菌（P．e）脂多糖（LPS）对小鼠成骨细胞 IL-23mRNA 和蛋白表达的影响,以及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路是否参与了该过程。方法：采用 real-time PCR 和 Western blot 法检测 P．e LPS 诱导 MC3T3-E1细胞表达IL-23mRNA 和蛋白的情况,以及用 PI3K 信号通路抑制剂 LY294002预处理细胞后,IL-23mRNA 和蛋白表达的变化。结果：P．e LPS 刺激 MC3T3-E1细胞后,IL-23mRNA 的表达增加具有浓度依赖性和时间依赖性（P ＜0．05）,IL-23蛋白的表达增加具有时间依赖性（P ＜0．05）;LY294002预处理细胞后,P．e LPS 诱导的 IL-23mRNA 和蛋白的表达均显著降低（P ＜0．05）。结论：P．e LPS 能诱导小鼠成骨细胞表达 IL-23mRNA 和蛋白,PI3K 信号通路可能参与了此过程。     

吸烟对口腔黏膜上皮细胞NOD1信号通路关键分子表达水平的影响

目的：探讨吸烟与口腔黏膜上皮细胞NOD1信号通路关键分子表达水平的关系。方法：采用商业化可购的直接烟暴露装置,构建体外Leuk－1细胞吸烟模型,将其分为吸烟组（分别吸入香烟烟雾5、10、20、40、60 min）和对照组（吸入含5％CO2空气10 min）,应用间接免疫荧光法检测体外吸烟对口腔黏膜上皮细胞NOD1通路内关键蛋白的表达。结果：随着体外吸烟时间的延长,NOD1蛋白表达水平逐渐下降,Caspase12和RIP2蛋白表达水平逐渐上升。NF－κB的蛋白表达水平逐渐上升之后明显下降。结论：吸烟可使口腔黏膜细胞NOD1信号通路相关蛋白表达发生改变,进而影响口腔黏膜固有免疫。     

牙龈卟啉单胞菌感染对人主动脉内皮细胞炎症反应的影响研究

目的　研究牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）感染对人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAECs）表达炎症因子的影响并探讨其可能的分子机制。方法　在体外以感染复数（multiplicity of infection，MOI）分别为0、25∶1、100∶1和200：1的P.gingivalis刺激HAECs 24 h后，分别采用实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验检测单核细胞趋化因子-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、Toll样受体（Toll like receptor，TLR）-2和TLR-4的表达水平；在体外以MOI分别为0和200∶1的P.gingivalis刺激HAECs 30 min后，采用凝胶迁移实验检测核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的活化水平。结果　P.gingivalis刺激组（MOI分别为25∶1、100∶1和200∶1）的HAECs中MCP-1、IL-1β、TLR-2和TLR-4的表达均显著高于未刺激组（MOI为0）（均P < 0.05），且提示这种上调作用呈P.gingivalis刺激剂量依赖性；P.gingivalis刺激组（MOI为200∶1）的HAECs中NF-κB活化水平显著高于未刺激组（MOI为0）（P < 0.05）。结论　P.gingivalis可能通过TLRs-NF-κB信号通路上调HAECs中炎症因子的表达，导致血管内皮功能紊乱，提示P. gingivalis可能促进动脉粥样硬化的发生和发展。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激口腔上皮细胞白细胞介素-8的表达

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下口腔上皮细胞白细胞介素-8（IL-8）的表达水平,初步探讨P.gingivalis致病性与其fimA基因型的关系。方法P.gingivalis ATCC 33277（Ⅰ型fimA）、W83、47A-1（Ⅳ型fimA）和KB细胞ATCC CCL-17共同孵育24 h,以未受刺激的KB细胞作为对照组,分别在1、3、6、24 h收集细胞和培养上清液。RT-PCR检测KB细胞IL-8 mRNA的动态表达,酶联免疫反应检测培养上清液中IL-8的动态变化。结果2种fimA基因型菌株刺激1 h,KB细胞IL-8 mRNA的表达上调至峰值,高于对照组,3~24 h IL-8 mRNA的表达水平接近对照组;P.gingivalis感染细胞后3~24 h,上清液中的IL-8水平低于对照组,Ⅳ型菌株低于Ⅰ型菌株;IL-8 mRNA及其蛋白表达不完全一致,提示IL-8的表达存在转录后水平的调节。结论fimA基因型与口腔上皮细胞IL-8的表达水平相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。     

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目的研究抗菌肽RISE—AP12对体外培养的牙龈91、啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）的抗菌活性。方法本研究于2012年10月至2013年1月在中国医科大学附属口腔医院中心实验室进行。以P．g W83为实验菌株,采用麦氏比浊法配制P.g W83混悬液（10^6 CFU／mL）备用,微量液体稀释法测定抗菌肽RISE—AP12对P．g W83的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）。结果抗菌肽RISE—AP12对10^6 CFU／mL P．g W83的MIC为0．01 mg／mL,MBC为0．02mg／mL。结论抗菌肽RISE—AP12对浮游状态下的P譬有抑菌（MIC为0,01 mg／mL）和杀菌（MBC为0．02 mg／mL）作用。     

Porphorymonas gingivalis induces intracellular adhesion molecule‐1 expression in endothelial cells through the nuclear factor‐kappaB pathway,but not through the p38 MAPK pathway

Zhang D, Zheng H, Zhao J, Lin L, Li C, Liu J, Pan Y. Porphorymonas gingivalis induces intracellular adhesion molecule‐1 expression in endothelial cells through the nuclear factor‐kappaB pathway, but not through the p38 MAPK pathway. J Periodont Res 2011; 46: 31–38. © 2010 John Wiley & Sons A/S Background and Objective: Porphyromonas gingivalis is a major pathogen in the development and progression of periodontal disease. The aim of this study was to investigate whether endothelial intracellular adhesion molecule‐1 (ICAM‐1), an inflammation biomarker for periodontitis, could be modified by infection with either of two strains of P. gingivalis with different virulence capacities: avirulent ATCC 33277 and virulent W83. Material and Methods: We examined the expression of ICAM‐1, IκBα, phospho‐p38 MAPK and nuclear factor‐kappaB (NF‐κB) p65 in an umbilical vein endothelial cell line (ECV‐304) treated with ATCC 33277 and W83, with or without the NF‐κB antagonist MG132 and/or a specific p38 inhibitor (SB203580), by real‐time PCR, western blotting and immunofluorescence. Results: Both strains could induce ICAM‐1 expression; additionally W83 was able to increase ICAM‐1 expression more significantly than ATCC 33277. In P. gingivalis‐infected endothelial cells, both p38 MAPK and NF‐κB signaling pathways were triggered by a rapid increase of p38 MAPK phosphorylation and a more delayed degradation of IκBα, followed by the nuclear translocation of NF‐κB. It was found that ICAM‐1 production in endothelial cells was abrogated by inhibition of the NF‐κB pathway, but not by inhibition of the p38 MAPK pathway, using the inhibitors of the latter two molecules. Conclusion: The induction of ICAM‐1 by infection of umbilical vein endothelial cells with P. gingivalis might be mediated through the NF‐κB pathway, but not by the p38 MAPK pathway.     

右旋氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响

目的 本实验研究右旋色氨酸、右旋亮氨酸、右旋酪氨酸和右旋蛋氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。方法 用含有维生素K(1 μg/mL)和氯化血红素(5 μg/mL)的TSB培养基培养牙龈卟啉单胞菌W83,培养到对数生长期时1：100倍稀释后放入96孔板中,分别加入右旋色氨酸(5 mmol/L)、右旋亮氨酸(8.5 mmol/L)、右旋酪氨酸(3 μmol/L)和右旋蛋氨酸(2 mmol/L),厌氧培养7 d后结晶紫染色,双蒸水冲洗,干燥后乙醇脱色,紫外分光光度计检测。 结果 加入右旋色氨酸、右旋亮氨酸、右旋酪氨酸和右旋蛋氨酸及空白对照组的吸收值分别为3.70 ± 0.06, 2.74 ± 0.18, 0.71 ± 0.04,3.42 ± 0.02,和3.65 ± 0.01。与空白对照组相比较,加入右旋亮氨酸组吸收值小,并有统计学差异(P < 0.01)。 结论 右旋亮氨酸能够减少牙龈卟啉单胞菌生物膜形成。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人主动脉内皮细胞表达ICAM-1影响的研究

目的:分别观察牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)和大肠杆菌(E.coli)LPS对人主动脉内皮细胞(HAECs)在转录和翻译水平表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的影响。方法:在体外分别以P.gingivalisLPS和E.coliLPS刺激HAECs,实时荧光定量PCR技术检测ICAM-1基因表达,蛋白质印迹技术检测ICAM-1膜蛋白表达。采用SPSS18.0软件包中ANOVA对数据进行分析。结果:P.gingivalisLPS作用6 h后开始诱导ICAM-1 mRNA表达,14 h达到高峰,22 h仍有高表达,各时间点与未刺激组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而E.coliLPS作用2 h后即开始诱导ICAM-1 mRNA表达,14 h达到高峰,22 h仍有高表达,各时间点与未刺激组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。两种LPS均能在蛋白水平上调ICAM-1的表达,这种上调作用呈浓度和时间依赖,且P.gingivalisLPS的作用较之E.coliLPS要缓和。结论:P.gingivalisLPS能够在转录和翻译水平上调HAECs表达ICAM-1,提示P.gingivalisLPS在动脉粥样硬化(AS)的发生发展过程中可能发挥了重要作用。E.coliLPS可能与急性炎症性疾病有关而与AS无关。     

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??Objective    To study the adhesive and invasive potential of PG0352 mutant strain interacting with KB cell. Methods    This study was carried out at Center Laboratory of School and Hospital of Stomatology??China Medical University from July to December 2014. Porphyromonas gingivalis??P. gingivalis??W83 or PG0352 mutant strain and KB cells were cocultured by MOI 100??1 for 2 h. Transmission electron microscopy was used to see whether P. gingivalis W83 and PG0352 mutant strain existed in KB cell. P. gingivalis in the coculture medium were removed??and P. gingivalis??which adhered to and invaded KB cell were released after lysis KB cells and then P. gingivalis were coated to the BHI plate. The invasive ability of P. gingivalis W83 and PG0352 mutant strain was measured by means of an antibiotic protection assay. Results    Both P. gingivalis W83 and PG0352 mutant strain adhered to and entered KB cells. ??15.559 ± 2.020??% P. gingivalis W83 and ??9.309 ± 1.750??% PG0352 mutant strain adhered to KB cell??and ??0.651 ± 0.287??% P. gingivalis W83 and ??1.517 ± 0.233??% PG0352 mutant strain  invaded into KB cell??both with statistical difference. Conclusion    Both P. gingivalis W83 and PG0352 mutant strain can adhere to and enter KB cell. Compared to P. gingivalis W83??less PG0352 mutant strain can adhere to KB cell and more PG0352 mutant strain can invade into KB cell.     

牙龈卟啉单胞菌侵入对血管内皮细胞E选择素表达的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277和W83侵入对血管内皮细胞E选择素转录和翻译的影响。方法：建立体外P.g侵入血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测E选择素基因表达;蛋白质印迹技术检测E选择素膜蛋白表达的变化;采用SAS8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析,P〈0.05为差异有统计学意义。结果：P.gATCC33277和W83侵入后4h即上调E选择素基因表达（P〈0.05）,8h显著回落（P〈0.05）,24h恢复至基线水平;E选择素基因在P.gATCC33277/W83侵入后4h、8h、24h和TNFα处理0.5h后的相对表达水平分别为对照组的294.0%/326.4%、179.3%/224.6%、126.7%/128.3%和365.5%。P.g侵入后4h即诱导E选择素蛋白表达（P〈0.05）,8h达高峰（P〈0.05）,24h有持续高表达（P〈0.05）;E选择素蛋白相对表达水平分别为对照组的295.4%/343.6%、386.3%/394.3%、238.7%/296.4%和413.8%。P.gW83诱导血管内皮细胞E选择素表达的能力强于ATCC33277（P〈0.05）。结论：P.g侵入可造成血管内皮细胞E选择素高表达的动脉粥样硬化样改变,在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要意义。     

Ⅰ、ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌对内皮细胞与平滑肌细胞共培养体系产生内皮素-1及一氧化氮的影响

［摘要］ 目的 研究不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）刺激人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）及人脐动脉血管平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs）共培养体系产生内皮素-1（endothelin-1,ET-1）和一氧化氮（NO）的水平。方法 用ⅠfimA型P.gingivalis（ATCC 33277）和ⅣfimA型P.gingivalis（W83）分别刺激HUVECs-HUASMCs共培养体系,于2、8、24、48 h时收集细胞培养上清液,酶联免疫反应检测ET-1的含量,硝酸还原酶法测定NO的含量。各组均设阴性对照组（纯培养基）及阳性对照组（1 μg/mL E.coli-LPS）。结果 HUVECs-HUASMCs共培养体系在Ⅰ、ⅣfimA型P.gingivalis刺激作用下产生ET-1和NO的量以及ET-1/NO水平,与阴性及阳性对照组比较存在差异。ⅠfimA型P.gingivalis刺激细胞共培养模型分泌ET-1和NO情况的总趋势与阴性对照组相似、而ⅣfimA型P.gingivalis的刺激作用总趋势则与阳性对照组相似,ⅣfimA型P.gingivalis较ⅠfimA型P.gingivalis刺激共培养细胞可分泌更多的ET-1、而NO量减少,ⅣfimA型P.gingivalis感染48 h的细胞共培养模型表现出明显的ET-1/NO的失衡。结论 不同fimA型P.gingivalis刺激共培养模型后产生ET-1及NO的情况及ET-1/NO的水平有明显差异,可能与其本身毒力相关,ⅣfimA型P.gingivalis比ⅠfimA型P.gingivalis更易引起内皮功能紊乱。     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞产生sICAM-1的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)对人类脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)产生可溶性细胞间粘附分子－1（soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)的影响。方法：应用厌氧袋法培养P.gingivalis，并用其感染HUVECs，采和酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定培养上清中sICAM-1的含量，结果：HUVECs基础表达少量的sICAM-1;P.gingivalis剂量依赖性增强HUVECs产生sICAM-1蛋白的水平；紫外线、超声波和65℃的热处理都不能抑制P.gingivalis的作用；sICAM-1蛋白水平在P.gingivalis刺激后的4h未见改变，增高的作用从刺激后的8h开始，在12h,16h和20h继续增加。结论：活的和灭活的P.gingivalis都剂量依赖性和时间依赖性地增强HUVECs产生sICAM-1,P.gingivalis可能同样诱导牙龈血管内皮细胞表达sICAM-1，升高的sICAM-1可能参与调节牙周病炎症反应和免疫反应过程。     

Effect of gamma-immunoglobulin on the asaccharolytic growth of Porphyromonas gingivalis

BACKGROUND AND OBJECTIVES: A minimal medium is indispensable for examining the growth properties of the asaccharolytic bacterium, Porphyromonas gingivalis. The purpose of the present study was to improve the widely used KGB medium to support good growth of P. gingivalis. MATERIAL AND METHODS: Growth of P. gingivalis (W50, W83, and ATCC33277) in a minimal medium was monitored by measuring the optical density of the culture during incubation. RESULTS: W50, W83, and ATCC33277 grew poorly with bovine serum albumin as the sole carbon and nitrogen source, and alpha-ketoglutarate had little or no effect on this poor growth. In contrast, FeCl3 improved the growth of W83 and ATCC33277; however, the use of a high concentration of FeCl3 elicited black pigmentation of the cells. Bovine gamma-immunoglobulin greatly recovered the growth defect. None of alpha-ketoglutarate, citrate, or trace metal ions, when used to supplement KGB medium, was required for growth. We determined the optimal conditions for growth, and developed a new simple minimal medium for P. gingivalis (GA medium). Growth of ATCC33277 in GA medium was dependent on gingipains; Arg-gingipains and Lys-gingipain contributed comparably to proliferation of the bacterium. CONCLUSION: These data indicate that GA medium is currently the most reliable minimal medium for examining the growth properties of P. gingivalis.