新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景:神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的:观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法:从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论:从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化

背景：体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：建立大鼠神经干细胞的分离、培养、纯化方法,进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：利用无血清悬浮神经球方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,进行形态学观察,用免疫细胞化学方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物,流式细胞仪检测细胞标志物及其比例。结果与结论：无血清悬浮神经球培养下大鼠神经干细胞生长稳定,操作简单,可大量分离、纯化、扩增神经干细胞,所获细胞具有神经干细胞的一股生物学特性,流式细胞仪检测第3代神经干细胞巢蛋白达91．5％,并具有多向分化潜能,免疫化学染色及流式细胞仪示神经干细胞可分化形成神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞。     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的:从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆,对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定,检测所分离细胞群的增殖分化特性。方法:实验于2005-07/10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只,利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后,以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。结果:实验选用昆明种新生24h内小鼠12只,全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化:神经干细胞以神经球的方式悬浮生长,无明显突起,原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满,活力状态好,绝大多数在1d内贴壁,并从细胞球边缘伸出突起,加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化,克隆球周围有细胞移出,7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果:原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色,证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性;细胞经BrdU标记后,行BrdU免疫细胞化学染色,部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定:对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测,表达均呈阳性。结论:成功分离并获得新生小鼠脑海马神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能。     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的：从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆，对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定．检测所分离细胞群的增殖分化特性。 方法：实验于2005-07／10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只，利用神经于细胞条件培养基和单细胞克隆技术，从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后，以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。 结果：实验选用昆明种新生24h内小鼠12只，全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化：神经干细胞以神经球的方式悬浮生长。无明显突起，原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满，活力状态好，绝大多数在1d内贴壁，并从细胞球边缘伸出突起，加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化，克隆球周围有细胞移出，7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果：原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色。证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性；细胞经BrdU标记后，行BrdU免疫细胞化学染色，部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定：对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测，表达均呈阳性。 结论：成功分离并获得新生小鼠脑海马神经于细胞，该细胞可连续传代，具备多向分化潜能。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数1O％胎牛血清的DMEM,F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestir。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6．0％-7．0％;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37．9％。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型B微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞的研究是最近几年来神经科学及胚胎发育学的热点问题。人们通常认为成年哺乳动物的中枢神经系统组织是不可再生的，中枢神经系统损伤或神经系统退行性病变将只能由神经胶质爬行替代，遗留难以弥补的神经系统功能缺损。而神经千细胞特别是在成年哺乳动物中枢神经系统中发现的神经千细胞对以上观点产生了巨大的冲击。随着神经干细胞的研究深入，必将为神经系统损伤性、退行性疾病的彻底治愈，甚至神经移植治疗带来一次革命性突破。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景:体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素.目的:在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成.材料:14～16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况.结果:培养48～72h细胞聚集悬浮生长,形成典犁的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达.传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5～7d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.结论:利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞.     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养**

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清 DMEM 培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物 nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU 掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化

背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后,制成单细胞悬液,加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养,传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示,诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1,Col-Ⅰ,牙本质涎蛋白表达阳性外,还有巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性,而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞,在一定的诱导培养条件下,牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

海人酸对神经干细胞增殖及分化的影响

背景：神经干细胞对脑组织的修复作用非常有限,约80％新增殖的内源性神经干细胞在6周内死亡,仅0．2％的细胞继续增殖、分化,参与修复。目的：分析不同剂量海人酸在对神经干细胞增殖及分化的影响。方法：体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,将神经干细胞分为空白对照组和加入不同浓度梯度的海人酸组,通过免疫组化法和免疫荧光法进行鉴定,MTT比色法测定海人酸对神经干细胞分化的影响,计算分化后神经元和星形胶质细胞比例。结果与结论：海人酸组贴壁的神经球分化速度较空白对照组快,在同一时间点进行观察,神经细胞的迁移距离较未处理组远。分化5d后,海人酸组所分化的细胞中,星状细胞较空白对照组多,而神经元样细胞相对较少,培养的细胞具有自我更新和向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能。兴奋性氨基酸海人酸可使部分神经干细胞死亡,但可促进幸存的神经干细胞增殖及分化,并诱导其向星形胶质细胞分化。     

神经干细胞培养及其影响因素

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素,为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24h内SD大鼠的大脑,剪碎离心后以1×108L-1的浓度接种,经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4h后改用无血清条件培养基（DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27）培养,2d或3d换液1次,6d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性;免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。结果与结论：出生24h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞;血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率;免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。     

不同麻醉肿胀液干预脂肪干细胞的生长增殖与成脂分化

背景：不同的麻醉肿胀液成分及浓度对脂肪细胞及所获取的人脂肪干细胞的生物学特性是否存在毒性反应等负面影响,至今仍不得而知,国内外亦未见相关研究报道。目的：观察不同麻醉肿胀液对体外培养条件下人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响,以减少麻醉药物对其损害,提高人脂肪干细胞的利用率。方法：分离人脂肪干细胞并行原代及传代培养,取P3代细胞以终浓度为0.2g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液进行干预,并设立对照组。分析人脂肪干细胞受损及生长增殖情况并比较其成脂分化率。结果与结论：与对照组比较,各麻醉组每个时间点细胞上清液中乳酸脱氢酶值均增高,吸光度值降低,差异均有显著性意义（P〈0.05）;而布比卡因组与利多卡因组、罗哌卡因组比较,差异也有显著性意义（P〈0.05）。但各麻醉组人脂肪干细胞成脂分化率与对照组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）。说明终浓度为0.2g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液对人脂肪干细胞生长增殖有一定的抑制作用,但不影响其成脂分化能力。     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖分化的作用

目的：探讨外源性神经节苷脂（GM1）对从大鼠分离培养的神经干细胞（NSCs）增殖及分化的作用。方法：①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮质和海马分离培养原代细胞，加血清诱导其分化。（④在NSCs培养基和DMEM／F12培养基中加入不同浓度的GM1，观察GM1对NSCs增殖和分化的作用。结果：①与不含GM1的NSCs培养基相比，在NSCs培养基中加入低浓度的GM1，NSCs的生长无明显改变，随着GM1浓度的增加，NSCs克隆球体积逐渐减小，细胞逐渐死亡；②在DMEM／F12培养基中单独加GM1而不加血清，NSCs克隆球均未见继续生长，也未见分化，而是迅速的死亡。结论：①在NSCs培养基中，低浓度（12．5μg／m1）GM1对NSCs的增殖无明显影响，但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用。②DMEM／F12培养基中单独加GM1，而不加血清和其他生长因子，既不能诱导NSCs分化，也不利于NSCs的继续生长。     

不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响

背景：冻存是保证干细胞移植治疗的关键步骤之一。传统的冻存是将细胞直接置于冻存液中进行保存,然而冻存液中二甲基亚砜虽能减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜产生的机械性损伤,但同时又对细胞具有毒性作用,直接影响细胞生存状态,不利于临床移植治疗。目的：寻找适宜牙周膜干细胞体外扩增的牙周周组织冻存的最佳方案。方法：收集健康人牙,刮取牙周组织后将其平均分为3等份,随机分为新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组,后2组分别以体积分数5%和10%二甲基亚砜添加冻存1个月后提取牙周膜干细胞。新鲜组直接提取牙周膜干细胞。结果与结论：5%二甲基亚砜组原代细胞游出组织团块所需时间和细胞收获量虽不及新鲜培养组,但却明显优于10%二甲基亚砜组（P〈0.05）。新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组第1代牙周膜干细胞克隆形成率、活细胞比率、第3代牙周膜干细胞BrdU细胞增殖能力、MTT细胞生长曲线和牙周膜干细胞表面标志物表达差异没有显著性意义（P〉0.05）。提示5%二甲基亚砜添加冻存体系不仅能比10%二甲基亚砜添加的普通冻存体系明显缩短牙周膜干细胞体外扩增所需时间,增加细胞收获量同时还能保持细胞基本生物学特性,降低二甲基亚砜的总体用量和其在反复冻存复苏细胞过程中对细胞造成的直接损伤,为未来更加安全的实施临床移植治疗提供了保障,是供体组织储存新的选择。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

低氧环境下白细胞介素1β诱导中脑源性神经干细胞的分化

背景：在体外某些外来信号的调控和诱导下,神经干细胞可定向诱导分化成与受体部位细胞类型与构成相似的细胞群体,使其更容易掺入靶组织,并可满足移植所需的细胞数量,提高移植细胞的存活率。目的：验证白细胞介素1β在低氧环境下体外诱导中脑源性神经干细胞的分化。方法：分离孕12d胎鼠中脑组织,培养神经干细胞、传代并鉴定。将鉴定后传代培养的中脑源性神经干细胞按分组接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12＋白细胞介素1β培养基;分别置于常氧（体积分数21%O2）和低氧（体积分数3%O2）环境下诱导分化,诱导分化9-11d后行小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶免疫细胞化学染色,检测酪氨酸羟化酶及神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率。结果与结论：与常氧组比较,低氧组尤其是低氧＋白细胞介素1β组中酪氨酸羟化酶阳性神经元的突起数目更多,且长度更为延长。孕12d胚鼠腹侧中脑组织可以在体外培养传代、并能诱导分化成多巴胺能神经元;在低氧环境或低氧＋白细胞介素1β诱导下,分化率均高于常氧组,其表型更成熟。说明在低氧或低氧和白细胞介素1β诱导下,可明显促进中脑源性干细胞分化为形态及功能成熟的多巴胺能神经元。