环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。     

携带人骨形态发生蛋白2可诱导慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的成骨

目的：观察携带骨形态发生蛋白2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞转染表达及稳定转染后成骨的影响。方法：取第3代人脐带间充质干细胞分组培养：实验组稳定转染携带骨形态发生蛋白2的tet-on慢病毒载体,并加入10mg/L强力霉素;未加强力霉素组：同实验组但不加强力霉素;空病毒组转染携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体;空白对照组未进行任何处理。结果与结论：①骨形态发生蛋白2表达：实验组、未加强力霉素组均有表达,且实验组表达量高于未加强力霉素组（P〈0.05）;空病毒组、空白对照组未见表达。②碱性磷酸酶染色：实验组可见细胞胞浆中出现大量红色或红棕色颗粒,未加强力霉素组可见少量红色颗粒,实验组碱性磷酸酶活性高于未加强力霉素组（P〈0.05）;空病毒组、空白对照组未见明显红色颗粒。③茜素红染色：实验组、未加强力霉素组均可见钙结节形成,实验组较未加强力霉素组矿化结节数量多,面积更大;空病毒组、空白对照组未见明显矿化结节形成。表明携带骨形态发生蛋白2的慢病毒载体可稳定转染人脐带间充质干细胞,显著增强其成骨能力。     

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景:肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成,已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗.目的:鉴于重组腺病毒的宿主范围广,探讨重组腺病毒介导的入肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、日的蛋白表达及细胞活性的影响.设计、时间及地点:2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验.材料:清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠.方法:向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导.以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞.主要观察指标:油红O染色检测成脂情况.流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达,计算转染效率.EUSA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达,MTT法检测转染脂肪细胞的活性.结果:①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴,成脂率(97.31±0.46)%.②以100 pfu/cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72 h后,绿色荧光蛋白表达量达高峰,此时转染效率为65.39%.③以100 pfu/cell作为最佳感染强度转染脂肪绌胞72 h后,肝细胞生长因子的表达量为峰值.与未转染空白对照比较,转染后24,48,72,96,168 h脂肪细胞活性均无明显变化(t=0.024～0.092,P>0.05).结论:重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞,有效表达目的蛋白,且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响.     

基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

背景：目前国内外构建组织工程脂肪的方法并不完善,虽然构建出了脂肪,但效果不理想。目的：探讨一种新的构建组织工程脂肪的方法,观察携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白复合后在Wistar大鼠体内构建组织工程脂肪的能力。方法：分离培养人脐带间充质干细胞,将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体以最适MOI=10转染人脐带间充质干细胞,将转染组与未转染组（对照组）的人脐带间充质干细胞分别接种于丝素蛋白支架,移植于Wistar大鼠背部皮下。移植后12周取材,行荧光原位杂交技术鉴定、组织形态学和扫描电镜观察。结果与结论：①油红O染色显示,两组移植物均呈阳性,证明移植物己在体内合成为脂肪组织,转染组脂肪样细胞数量明显高于对照组（P〈0．01）。②苏木精一伊红染色显示,两组移植物组织结构与正常脂肪组织相似,可见明显新生血管。转染组支架材料降解明显,炎性细胞浸润明显少于对照组,新生血管数量也多于对照组。③扫描电镜观察提示,转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团,其结构与正常脂肪组织相似;对照组脂肪样细胞散在分布于支架孔隙内。④提示胰岛素基因能明显促进人脐带间充质干细胞成脂肪化,携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合后,在Wistar大鼠体内能构建出组织工程化脂肪组织,其结构类似正常脂肪组织。     

慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞后其分化潜能的研究

本研究探讨携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体（lentiviral vector,LV）转染人骨髓间充质干细胞（mesenehymal stem cells,MSC）后的分化能力。从骨髓中分离、培养MSC,通过携带EGFP标记的慢病毒载体体外转染人MSC,观测绿色荧光蛋白的表达情况。最后,应用成脂诱导培养基（胰岛素、吲哚美辛、甘油3．磷酸酰基转移酶IBMX、地塞米松）定向诱导分化已转染的MSC为脂肪细胞,苏丹黑染色观察诱导情况。结果表明,转染72小时后的MSC在荧光显微镜下显现弱荧光;经脂肪诱导培养基培养21天后在显微镜下可观察到细胞胞浆内形成高度折光性的脂滴,苏丹黑染色呈橘红色,且转染组与未转染组差异不大（P〉0．05）。结论：成功应用携带EGFP基因的慢病毒载体对MSC进行基因修饰,使转染后的MSC仍具有分化能力,能被诱导为脂肪细胞。MSC可作为基因治疗的一种靶向性细胞．     

增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞诱导其向神经元样细胞分化的示踪标记观察

目的：建立携带示踪标记的人骨髓间充质干细胞，并将其向神经元样细胞定向诱导分化。方法：实验于2003—10／2005-01在郑州大学干细胞研究中心完成。用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中，然后用表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导法将其向神经元样细胞诱导分化，并用反转录聚合酶链反应法对诱导后的细胞进行鉴定。结果：①转染48h后，在荧光显微镜下观察，对照组的人骨髓间充质干细胞不发荧光，而实验组的人骨髓间充质干细胞开始发荧光，经G418筛选后得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的人骨髓间充质干细胞。②转染后的人骨髓间充质干细胞经重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导后，较多细胞出现了典型的神经元样形态，经反转录聚合酶链反应法证明，神经元特征性蛋白微管相关蛋白2和神经丝亚单位-M表达增强。结论：应用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中可获得稳定表达，转染后的人骨髓间充质干细胞，经表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导后可以向神经元样细胞定向分化。     

改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪

背景：构建工程化的脂肪组织,适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。目的：探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。方法：选取生长良好的第3代人脂肪间充质干细胞,用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒进行感染。将慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞成脂诱导14 d,油红O染色观察细胞的成脂能力;将慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞分别接种于壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上,MTT法检测细胞增殖能力;成脂诱导14 d后进行油红O染色,RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达。结果与结论：成脂诱导14 d后,慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞均可见成熟脂肪细胞,组间差异不明显。慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白支架的生长曲线相近;成脂诱导后,油红O染色及RT-PCR均显示生成大量成熟脂肪细胞。表明携带重组人血管内皮细胞生长因子基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后,不影响其生长及成脂能力,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料可成功构建组织工程化脂肪。     

原子力显微镜观察人脐带间充质干细胞:生物学特性与超微结构的关系

背景:细胞形态结构和功能密不可分,但目前对人脐带间充质干细胞超微结构的报道还很少.目的:探讨人脐带间充质干细胞的生物学特性与原子力显微镜下超微结构的关系.方法:采用酶消化法体外分离培养并扩增人脐带间充质干细胞,取第3代细胞,用原子力显微镜在接触模式下观察成像,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期,油红O染色及碱性磷酸酶染色鉴定其成脂、成骨分化潜能.结果与结论:第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34;有80%以上的细胞处在G_0/G_1期,增殖指数为19.9%;成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量桔红色的小脂滴;成骨诱导后,碱性磷酸酶染色可见立方形、多边形细胞的胞质染成棕褐色.原子力显微镜下人脐带间充质干细胞以长梭形为主,细胞骨架丝明显,并形成网状连接,这与其强大的增殖、迁移、分化功能相适应.     

增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞诱导其向神经元样细胞分化的示踪标记观察

目的:建立携带示踪标记的人骨髓间充质干细胞,并将其向神经元样细胞定向诱导分化。方法:实验于2003-10/2005-01在郑州大学干细胞研究中心完成。用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中,然后用表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导法将其向神经元样细胞诱导分化,并用反转录聚合酶链反应法对诱导后的细胞进行鉴定。结果:①转染48h后,在荧光显微镜下观察,对照组的人骨髓间充质干细胞不发荧光,而实验组的人骨髓间充质干细胞开始发荧光,经G418筛选后得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的人骨髓间充质干细胞。②转染后的人骨髓间充质干细胞经重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导后,较多细胞出现了典型的神经元样形态,经反转录聚合酶链反应法证明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白2和神经丝亚单位-M表达增强。结论:应用阳离子脂质体转染法将增强型绿色荧光蛋白基因转入人骨髓间充质干细胞中可获得稳定表达,转染后的人骨髓间充质干细胞,经表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导后可以向神经元样细胞定向分化。     

HCN4基因体外转染大鼠MSCs建立起搏离子通道

目的：通过构建HCN4腺病毒载体,以大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）为基因转染的平台,观察HCN4外源基因对MSCs转染效果及其功能表达。方法：携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs,测定转染效率,免疫荧光法测定HCN4蛋白表达,膜片钳全细胞记录If电流。结果：携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs后可检测到HCN4蛋白及If电流表达。结论：携带HCN4腺病毒载体转染大鼠MSCs后可使MSCs表达HCN4蛋白及If电流,可为生物心脏起搏治疗提供合适的靶基因及种子细胞。     

人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞

背景：脐带间充质干细胞具有多向分化能力,但其向成纤维细胞分化研究较少。目的：验证人脐带间充质干细胞向成纤维细胞的分化能力。方法：采用贴壁法分离脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析其表面抗原。取第3代脐带间充质干细胞进行成脂成骨诱导分化,以碱性成纤维细胞生长因子诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。结果与结论：贴壁法能稳定从脐带中分离出干细胞,脐带间充质干细胞极低表达 CD31、CD45、CD40、HLA-DR,强表达 CD29、CD90、CD44、CD105。脐带间充质干细胞成脂诱导后油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴;成骨诱导后茜素红染色可在细胞密集区见红色的钙结节。碱性成纤维细胞生因子诱导后细胞表达Ⅰ型胶原明显高于对照组。提示贴壁法分离脐带间充质干细胞可靠、纯度高,碱性成纤维细胞生长因子可诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。     

地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

背景：在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的共同作用下,人脐带间充质干细胞可以向成骨细胞分化。作为糖皮质类激素的地塞米松,其浓度对人脐带间充质干细胞体外成骨分化存在着影响。目的：探寻人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中地塞米松的优选浓度。方法：采用植块法从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞。取第3代细胞进行日常细胞培养和诱导分化实验。流式细胞术检测所获细胞的表面标记表达情况,成脂、成骨诱导分化鉴定人脐带间充质干细胞。倒置相差显微镜观察成骨分化过程中细胞形态的变化。以含1×10^-8mol／L,5×10^-8mol／L,1×10^-7mol／L3种浓度地塞米松的成骨诱导液对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导。盐酸四环素荧光及VonKossa染色法对比观察钙结节形成。反转录一聚合酶链反应法对比检测细胞骨桥蛋白基因表达。结果与结论：植块法分离的人脐带间充质干细胞形态均一,多为梭形,平行排列生长或旋涡状生长。流式细胞术检测CD29,CD73和CD90呈阳性表达,CD31,CD34和HLA-DR呈阴性表达。成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。盐酸四环素荧光结果和VonKossa染色结果显示,所形成的钙结节大小及数量,均随着地塞米松浓度的增加而增强、增多。反转录一聚合酶链反应检测结果显示,3种浓度地塞米松组的骨桥蛋白基因均有表达,且表达强度随着地塞米松浓度的增加而增强。提示成骨诱导液中地塞米松浓度为1×10^-7mol／L时,能更有效地诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

背景：近年来研究证明间充质干细胞具有高度增殖和多向分化潜能,是一种理想的组织工程种子细胞,能高效转染表达外源性目的基因,在基因治疗领域具有广阔的应用前景。目的：将含有NEP1-40基因的慢病毒载体转染脐血间充质干细胞,评价基因转染后脐血间充质干细胞生物学功能变化,观察NEP1-40在脐血间充质干细胞中的表达。方法：体外分离和培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记,并对其生物学特性进行鉴定。同时将NEP1-40基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染脐血间充质干细胞。结果与结论：实验通过密度梯度离心法成功在体外分离和培养脐血间充质干细胞,诱导其向脂肪细胞分化,流式细胞仪检测结果显示脐血间充质干细胞中CD90、CD73及CD105蛋白阳性,不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白;real-timePCR检测发现其NEP1-40mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,NEP1-40的表达量越高,此外转染NEP1-40后的脐血间充质干细胞中可检测到NEP1-40蛋白,提示NEP1-40基因转染后脐血间充质干细胞原有的生物学功能无明显影响。     

冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

背景：低温冻存脐带间充质干细胞已成为研究热点,但关于冻存后其造血支持能力变化的报道甚少。目的：比较冷冻前后脐带间充质干细胞体外支持成人骨髓单个核细胞造血集落生成的能力。方法：分别将冷冻前后的人脐带间充质干细胞和人骨髓来源的间充质干细胞培养至第3代,经2.5g/L丝裂霉素C处理制备为细胞滋养层,与成人异体骨髓单个核细胞共培养。体外培养至35d应用甲基纤维素法检测造血干/祖细胞集落的增殖状态。结果与结论：冷冻人脐带间充质干细胞组集落形态、大小上与骨髓间充质干细胞组和未冷冻人脐带间充质干细胞组相似,3者均比空白组集落数量多,差异有显著性意义（P〈0.05）。与未冷冻人脐带间充质干细胞组相比,冷冻人脐带间充质干细胞组集落数更少,差异有显著性意义（P〈0.05）。实验结果说明冷冻前后人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对骨髓单个核细胞均有造血刺激作用,但人脐带间充质干细胞冷冻后的造血支持作用有所减弱。     

人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达

背景：人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,经诱导后是否可向心肌细胞分化？目前的报道尚不多。目的：观察人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后肌钙蛋白I的表达情况。方法：取第2代人脐带间充质干细胞标本,经消化、离心、沉淀后,分为7份,制成细胞悬液,调整细胞浓度为2×10^7L^-1,分别加入浓度为80,40,20,10,5,2．5,0μmol／L5-氮胞苷于同样条件继续培养,作用24h后除去,继续培养4周。结果与结论：①人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷处理24h之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol／L组细胞形态变化明显。②免疫组化染色显示5,10,20,40,80μmol／L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性,对照组与2．5μmol／L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性。选取5个高倍视野进行细胞计数,80,40,20,10μmol／L组间心肌样细胞的转化率差异无显著性意义,均明显高于5μmol／L组（P〈0．05）。⑨超微结构观察显示经5-氮胞苷诱导后4周时部分人脐带间充质干细胞内可见典型的肌小节及心房颗粒。而未经5-氮胞苷诱导的对照组无以上改变。结果提示经5-氮胞苷诱导后人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞转化。     

脐带和胚胎肝来源间充质干细胞生长特性的比较

背景：不同来源的干细胞具有不同的分子特征及生长特性,对疾病治疗的机制及效果可能会有所差异。目的：比较两种来源间充质干细胞的生物学特性。方法：分离培养人脐带源、胚胎肝来源的间充质干细胞,传至第5代时分别进行细胞形态观察,细胞群体倍增时间计算,细胞表面标志鉴定,诱导分化能力检测。另外将脐带源间充质干细胞继续培养至第10,15代,绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间。结果与结论：两种来源的间充质干细胞在对数生长期均为梭形,旋涡状生长,均具有成骨、成脂、成软骨分化的能力。两种间充质干细胞的生长曲线均为S形。第5代胎肝来源间充质干细胞的倍增时间为（34.37±0.31）h,脐带源间充质干细胞的倍增时间为（35.63±0.38）h,差异无显著性意义（P〉0.05）。第10代和第15代脐带源间充质干细胞的倍增时间分别为（52.6±0.53）h和（53.27±0.92）h,与第5代比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果可见两种来源间充质干细胞生物学特性基本相同,肉眼观察胎肝来源间充质干细胞比脐带源间充质干细胞形态稍小,增殖较快,但统计学上差异无显著性意义。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进

背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能,以及取材方便等优点而日益受到关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带,利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养,取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出,第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养,2d后即可见有细胞爬出,细胞生长速度较快,5d即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。细胞增殖能力旺盛,平均倍增时间为50 h左右,41.24%的细胞处于G2/S期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性,而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。