牛心包组织工程心脏瓣膜支架脱细胞的研究

目的 研究去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,去除新鲜牛心包组织细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料.方法 分别采用去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,处理新鲜牛心包组织,光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异.结果 3种方法均能完全去除细胞,与去污剂-酶消化法比较,其他2种方法对基质的破坏明显.结论 去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且具有良好的保护基质能力.     

京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究

目的：初步探讨新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛心包基质作为支架材料的影响及意义,为心肌组织工程心脏补片的构建提供较理想的生物支架材料。方法：实验分为三组,A组（25块）为新鲜未脱牛心包组织,B组（25块）为脱细胞牛心包组织,C组（25块）为京尼平交联的脱细胞牛心包组织。采用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;以组织厚度、热皱缩温度和抗拉力测试观察基质的物理性能变化。结果：光学显微镜、扫描电镜观察显示去污剂-酶消化法去细胞百分率达98.63%,能够有效脱除细胞,完整保留牛心包组织的胶原纤维和弹力纤维;组织厚度测试结果为,A组（3.8±1.0）mm,B组（3.8±1.2）mm,C组（4.0±1.0）mm;组织热皱缩温度测定结果为,A组（78.50±0.50）℃,B组（67.90±0.60）℃,C组（85.90±0.40）℃;组织抗拉力测试结果显示,经交联剂京尼平处理后C组最大载荷、最大应力、弹性模量、最大应变均高于A组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：经过新型生物交联剂京尼平交联的脱细胞牛心包最大载荷增加显著,可以弥补脱细胞牛心包力学性能的减少,作为较理想的心肌组织工程支架材料。     

牛心包脱细胞基质的研制

目的为组织工程学方法研制生物瓣提供适合的基质材料。方法用去污剂-酶联合四步法脱除牛心包组织中的细胞,并对处理后组织的理化性质进行分析、测试。结果脱细胞效果良好,且能较好地保持胶原纤维和弹性纤维的排列分布。脱细胞后的牛心包组织的厚度、抗拉负荷、抗拉强度、断裂伸长率和热皱缩温度无明显变化。组织中可溶性蛋白含量无显著变化,而作为结构成分的胶原蛋白和蛋白聚糖得到了较好的保存。结论去污剂-酶联合四步法能有效地制造牛心包脱细胞基质材料。     

牛心包脱细胞在质的研制

目的 为组织工程学方法研制生物瓣提供适合的基质材料。方法 用去污剂－酶联合四步法脱除牛心包组织中的细胞，并对处理后组织的理化性质进行分析、测试。结果 脱细胞效果良好，且能较好地保持胶原纤维和弹性纤维的排列分布。脱细胞后的牛心包组织的厚度、抗拉负荷、抗拉强度、断裂率和热皱缩温度无明显变化。组织中可溶性蛋白含量无显著变化，而作为结构成分的胶原蛋白和蛋白聚糖得到了较好的保存。结论 去污剂－酶联合四步法能有效地制造牛心包脱细胞基质材料。     

经单宁酸处理脱细胞猪心脏瓣膜性能及形态学研究

目的：对比加单宁酸和传统的去氧胆酸钠法去除细胞后心脏瓣膜形态学及性能差别,为构建组织工程心脏瓣膜提供实验依据。方法：应用两种方法处理6～7月龄猪主动脉心脏瓣膜。光学显微镜、透射电镜观察脱细胞基质改变、DNA含量测定。结果：两种方法处理后,显微镜检和透射电镜见单宁酸-去氧胆酸钠法对基质破坏较少;两组均可以完全脱去瓣膜细胞。结论：经单宁酸处理能更好地保护去除瓣叶组织细胞外基质,提高其性能。     

戊二醛联合丹宁酸处理增加去细胞牛心包的组织稳定性的实验研究

目的初步观察戊二醛联合丹宁酸处理对去细胞后牛心包组织稳定性的影响。方法新鲜牛心包切割成同样大小的试片数块,分为4组,A组：新鲜牛心包;B组：新鲜牛心包去细胞处理;C组：牛心包去细胞后丹宁酸处理;D组：牛心包去细胞后戊二醛联合丹宁酸处理。通过测定各组试片的厚度、热皱缩温度、抗拉负荷、抗张强度、断裂伸长率及抗胶原蛋白酶降解试验来比较各组的组织稳定性并行形态学和组织学观察。结果 D组在厚度、热皱缩温度、抗拉负荷、抗张强度及抗胶原纤维酶降解能力方面均高于B组（P〈0.05）,组织学发现D组纤维排列较B组更加紧凑。结论戊二醛联合丹宁酸处理能够增加去细胞后牛心包的组织稳定性。     

组织工程猪膀胱无细胞基质的制备

目的探讨猪膀胱无细胞基质制备的方法及其作为生物支架材料应用于组织工程膀胱构建的可行性。方法分别采用酶消化法和去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理并进行HE染色及电镜检查。应用MTT法进行细胞毒性测定。对5只新西兰兔行大部分膀胱切除术后,采用异种膀胱无细胞基质修补,6周后取材观察修复组织再生情况。结果两种方法均能去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好。兔膀胱修补后6周支架材料上有移行上皮及肌肉组织生长。结论经脱细胞处理的猪膀胱无细胞基质具有良好的组织相容性,有作为组织工程膀胱支架材料的应用前景。     

新型脱细胞小口径异种移植血管的初步研究

目的 探讨一种制备小口径异种移植血管的新方法,为冠状动脉旁路移植术提供新的移植血管来源.方法 利用酶-去污剂法去除犬颈动脉血管壁结构细胞,脱细胞后其中一部分再进行肝素结合,组织学及机械性能研究观察脱细胞效果.24只兔的左、右两侧颈动脉同时分别植入结合与未结合肝素的脱细胞异种血管,作为自身对照,分别于3周、3月和6月,用B超观察移植血管的通畅情况.术后3月随机处死12只兔,取材后行Ⅷ因子和α-肌动蛋白免疫组化检查.结果 脱细胞后管壁无细胞成分残留,而细胞外基质保存完好.植入兔颈动脉后两组均无血管阻塞,而肝素结合组血栓形成少于未结合组.3月后管壁出现平滑肌细胞,而内腔由内皮细胞覆盖.结论 酶-去污剂联合肝素结合处理是制备小口径异种移植血管可行的方法.     

新型脱细胞小口径异种移植血管的初步研究

目的探讨一种制备小口径异种移植血管的新方法,为冠状动脉旁路移植术提供新的移植血管来源。方法利用酶-去污剂法去除犬颈动脉血管壁结构细胞,脱细胞后其中一部分再进行肝素结合,组织学及机械性能研究观察脱细胞效果。24只兔的左、右两侧颈动脉同时分别植入结合与未结合肝素的脱细胞异种血管,作为自身对照,分别于3周、3月和6月,用B超观察移植血管的通畅情况。术后3月随机处死12只兔,取材后行Ⅷ因子和α-肌动蛋白免疫组化检查。结果脱细胞后管壁无细胞成分残留,而细胞外基质保存完好。植入兔颈动脉后两组均无血管阻塞,而肝素结合组血栓形成少于未结合组。3月后管壁出现平滑肌细胞,而内腔由内皮细胞覆盖。结论酶-去污剂联合肝素结合处理是制备小口径异种移植血管可行的方法。     

牛心包材料去细胞新方法的初步研究

目的:找到一种牛心包材料细胞成分清除率高,而对其力学性能影响小的理想去细胞方法.方法:取新鲜牛心包,用新洁尔灭-核酸酶-脱氧胆酸法去细胞处理;新鲜牛心包作对照组.用Lowry法测定牛心包可溶性蛋白含量;牛心包片用作HE染色及WT VG染色,作光镜检测并计算去细胞百分率,电镜观察组织超微结构;分别测定牛心包的组织含水量、厚度、抗拉强度、断裂伸长率及热皱缩温度.结果:牛心包去细胞处理后可溶性蛋白去除彻底,显著少于对照组(P＜0.01);去细胞百分率达95.43%,去细胞彻底.组织学及超微结构观察:实验组心包无细胞成分,胶原纤维结构无破坏,排列整齐,结构紧凑;实验组牛心包厚度[(0.209±0.066) mm] ,抗拉强度[(17.08±3.91) N/mm2],断裂伸长率[(41.27±6.45)%]及热皱缩温度[(68.94±0.75)℃]与对照组[分别为(0.247±0.055) mm; (17.97±4.77)N/mm2;(42.67±7.76)%,(69.44±0.57)℃] 差异均无显著性(P＞0.05).去细胞处理后,含水量与对照组(83.02±0.43%)相比明显增加(P＜0.01).结论:新洁尔灭-核酸酶-脱氧胆酸法去细胞彻底,对组织结构无破坏,对组织机械性能无明显影响,是一种快速、有效、实用的去细胞方法.     

胰蛋白酶法和Triton-X100法去除瓣膜细胞的效果比较

目的 比较胰蛋白酶法和Triton-X100法去除异种或同种心脏瓣膜上细胞的效果。方法 选取新鲜猪主动脉瓣膜片分别置入0.05%胰酶溶液和0.25%Triton-X100溶液中处理48h,并以未经处理的新鲜瓣膜片作对照,行光镜及电镜观察,并作热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率测定。结果 光镜和电镜下均显示,胰酶法和Triton-X100法均彻底去除了主动脉瓣膜上的细胞成分,但Triton-X100法对瓣膜支架结构的损伤较大。热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率在新鲜瓣膜组和胰酶组间无显著性差异,但Triton-X100组与新鲜瓣膜组及胰酶组相比均有下降。结论 胰酶法去除猪主动脉瓣膜细胞彻底,保持了瓣叶支架结构,优于Triton-X100法。     

胰蛋白酶法和Triton—X100法去除瓣膜细胞的效果比较

目的比较胰蛋白酶法和Triton—X100法去除异种或同种心脏瓣膜上细胞的效果。方法选取新鲜猪主动脉瓣膜片分别置入0．05％胰酶溶液和0．25％Triton-X100溶液中处理48h，并以未经处理的新鲜瓣膜片作对照，行光镜及电镜观察．并作热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率测定。结果光镜和电镜下均显示，胰酶法和Triton-X100法均彻底去除了主动脉瓣膜上的细胞成分，但Triton—X100法对瓣膜支架结构的损伤较大。热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率在新鲜瓣膜组和胰酶组间无显著性差异，但Triton—X100组与新鲜瓣膜组及胰酶组相比均有下降。结论胰酶法去除猪主动脉瓣膜细胞彻底．保持了瓣叶支架结构，优于Triton—X100法。     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

低免疫原性脱细胞神经基质的制备及其理化性能

目的：制备低免疫原性异种脱细胞神经基质并评估其理化性能。方法：以α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪坐骨神经为实验原料对基因敲除猪坐骨神经进行脱细胞处理制备低免疫原性异种脱细胞神经基质，通过HE、DAPI染色及DNA残留量检测评价神经组织的脱细胞效果；I型胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白免疫组织化学及天狼猩红染色评价脱细胞神经细胞外基质组分保留情况；α-1，3-半乳糖基（a-gal）免疫荧光检测异种抗原a-gal的残留；扫描电镜（SEM）分析脱细胞神经三维组织结构及孔隙率。结果：组织染色显示脱细胞神经基质内膜、外膜、束膜中的细胞均去除干净，DNA定量结果显示DNA含量下降了95%。天狼猩红染色及免疫组织化学结果显示脱细胞神经组织较好地保留了胶原纤维与细胞外基质主要蛋白。SEM结果显示脱细胞神经较好地保留了其三维组织结构，细胞毒性检测表明脱细胞神经基质无细胞毒性。结论：本研究自主设计的四联脱细胞方案能彻底去除神经组织中的细胞成分与异种抗原，并且较完整地保留了神经组织结构，与天然神经具有高度相似性。     

新生小牛皮肤的形态学和生物力学特点及脱细胞方法探索

目的通过新生小牛与成人皮肤组织在形态学和生物力学性能方面的对比研究,寻找临床应用牛真皮基质的可能证据,并初步探索对牛真皮组织进行脱细胞处理的方法。方法收集新生小牛和成人背部全层皮肤标本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、Gomori醛复红染色、扫描电镜和透射电镜的方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件的测量;采用力学生物材料试验机检测皮肤的力学性能。采用胰蛋白酶与去污剂的不同浓度和时间组合方式对牛真皮组织进行脱细胞处理,初步观察其脱细胞效果。结果新生小牛与人的皮肤比较,真皮和表皮的厚度均明显变薄,两者的比值显著减小;真皮内Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维分别较人真皮增多和减少,但真皮胶原纤维束的间隙率[(41.72±1.81)∶(40.66±1.40),P=0.467]和胶原纤维束粗细[(11.28±0.18)μm∶(10.88±0.66)μm,P=0.368]差异却没有统计学意义。扫描电镜观察可见新生牛真皮胶纤维束与人真皮胶原纤维束均较纤细,排列疏松,且有一定的孔隙分布;透射电镜显示新生牛真皮胶原原纤维横纹周期长度较人真皮短,但两者的胶原原纤维直径显著差异。生物力学检测示新生牛皮肤最大应力[(21.08±0.91)MPa]和杨氏模量[(82.12±1.23)MPa]均要明显高于人皮肤的最大应力[(12.76±1.60)MPa,P=0.001]和杨氏模量[(48.63±5.50)MPa,P=0.001],而最大应变却明显低于人真皮[(0.51±0.002)mm∶(0.75±0.028)mm,P=0.001]。脱细胞方法探索显示随着胰酶浓度的增加、处理时间的延长,新生牛真皮基质内细胞核成分越来越少,但对真皮胶原结构的破坏也越来越大。结论新生牛皮肤虽然在表皮与真皮厚度、真皮胶原类型比例以及生物力学上与人皮肤有明显差异,但真皮的胶原纤维束三维结构两者之间存在较大相似性。适当浓度和时间的胰蛋白酶组合可制备出空间结构和脱细胞效果较为理想的新生牛脱细胞真皮基质,为修复人体软组织缺损提供有应用前景的生物材料。     

去细胞处理对牛颈静脉带瓣管道细胞外基质骨架的影响

目的:探讨去细胞处理对牛颈静脉带瓣管道细胞外基质骨架成分及组织稳定性的影响,为确立构建组织工程化的人工血管技术提供依据.方法:采集新鲜牛颈静脉,筛选瓣膜功能良好的血管,采用曲那通X-100、胰蛋白酶/EDTA和DNase-I/RNase-A三步法去细胞处理,组织化学染色和透射电镜观察细胞外基质骨架成分(胶原和弹力蛋白)的变化.对新鲜和去细胞处理的牛颈静脉血管壁(n=10)分别进行弹力蛋白(Fastin弹性蛋白法)和羟脯氨酸(碱水解、分光光度法)含量测定;并测定处理前后的热皱缩温度和抗张强度以比较组织稳定性.结果:去细胞处理牛颈静脉血管壁光镜和透射电镜检测提示细胞及其成分完全去除,组织间隙增宽,但胶原成分较好保留,弹力蛋白部分减少及断裂.与新鲜组织比较,去细胞组羟脯氨酸含量相对增加[(25.73±2.97)mg/g vs.(29.25±2.99)mg/g,P＜0.05],弹力蛋白含量相对减少[(159.71±21.06)ng/g vs.(134.91±35.40)mg/g,P＜0.05],热皱缩温度降低[(72.50±0.53)℃ vs.(69.75±0.54)℃,P＜0.05],抗张强度也下降明显[(5.19±0.65)MPa vs.(3.13±0.94)MPa,P＜0.05].结论:去细胞处理对牛颈静脉细胞外基质骨架有一定损害,牛颈静脉的组织稳定性有所下降,得到的细胞外基质基本成分需经进一步交联处理才可以作为组织工程支架材料.     

渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮组织学和生物活性成分的影响

目的采用渗透冲击联合超声和去污剂处理新生牛真皮,观察处理前后新生牛真皮基质的组织学和生物活性成分的变化。方法从8头健康雄性新生牛皮肤获取网状层真皮组织。采用反复渗透压改变、超声震荡和去污剂联合法对新生牛网状层真皮进行处理,HE染色、DAPI染色和核酸电泳检测细胞成分残留情况;扫描电镜(SEM)观察胶原束结构和细胞成分;PicoGreen法、DMMB法和BCA法对脱细胞前后真皮基质的DNA、sGAG和蛋白质含量进行定量分析;ELISA法测定脱细胞前后真皮基质内TGF-β1、EGF、bFGF和KGF含量。结果形态学观察可见脱细胞处理后的真皮三维结构完整,胶原纤维束排列较疏松,细胞清除较彻底,未见明显细胞及细胞碎片残留。与脱细胞处理前比较,脱细胞处理后的DNA含量[(2 516.1±324.2)ng/mg vs(249.5±53.8)ng/mg,P=0.000)]、sGAG含量[(5.92±0.50)μg/mg vs(2.48±0.24)μg/mg,P=0.000]、TGF-β1含量[(478.8±196.1)pg/g vs(180.3±111.0)pg/g,P=0.009]和EGF含量[(10.52±2.78)pg/g vs未能检测到EGF含量]均明显减少;而bFGF含量[(788.6±333.8)pg/g vs(364.8±294.8)pg/g,P=0.424]下降了53.7%,KGF含量[(0.033±0.000)pg/g vs(0.033±0.000)pg/g,P=0.433]变化不显著。结论反复渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮基质明显地清除了细胞及细胞碎片,较好地保留了真皮细胞外基质的三维结构和主要生物活性成分。     

去细胞光氧化处理牛颈静脉带瓣管道的形态学研究

目的:评价去细胞结合光氧化技术处理的牛颈静脉带瓣管道(BJVC)组织相容性及组织稳定性.方法:取新鲜牛颈静脉20根, 每根裁出4个带瓣血管片,随机分为4组,分别以染料介导光氧化(DMP)、戊二醛(GA)、去细胞(DC)及去细胞结合光氧化(DC DMP)4种技术处理.通过组织蛋白提取实验观察BJVC去细胞后光氧化交联的时效性;建立大鼠皮下包埋模型,两月后获取组织标本,通过HE染色及电镜观察,比较4组试片的形态结构变化.结果:DMP交联的BJVC有明显的时效性,处理48 h后交联程度至最大;与其他组比较,大鼠皮下包埋后去细胞结合光氧化组试片柔韧性好,纤维结构较完整,有轻度降解现象,细胞生长良好.结论:去细胞结合光氧化处理的BJVC组织相容性好,适于细胞浸润生长,组织稳定性较好,降解速率可通过DMP处理时间调节,是一种较理想的可降解带瓣血管支架材料.