灵芝对肝癌干细胞糖代谢和标志物蛋白的影响

目的:探讨灵芝对人肝癌干细胞糖代谢及标志物CD133蛋白的影响。方法:培养人肝癌SMMC7721细胞并用灵芝L08处理,用MTT法测定细胞的成活率,用试剂盒法测定己糖激酶活性,用Western Blot法测定CD133蛋白的水平。结果:灵芝L08处理人肝癌SMMC7721细胞后,细胞的成活率及己糖激酶活性都有所降低。同时,肝癌干细胞的CD133蛋白水平也降低。结论:灵芝L08能抑制人肝癌细胞的增殖、细胞中己糖激酶的活性和CD133蛋白水平。     

大豆黄酮对肝癌SMMC7721细胞及其CD~(133)肿瘤干细胞增殖的影响

目的:探讨大豆黄酮对肝癌SMMC7721细胞及其CD133肿瘤干细胞增殖的影响。方法:取对数生长期的肝癌SMMC7721细胞,分别加入不同浓度的大豆黄酮,在24、48和72 h的时间点上,用MTT法测定大豆黄酮对肝癌SMMC7721细胞的抑制生长率。另外,将培养的细胞与CD133蛋白荧光素一抗标记混合,37℃孵育反应20 min,在525 nm波长下进行流式细胞仪检测。结果:大豆黄酮对于肝癌SMMC7721细胞在24、48和72 h内均有明显的抑制作用,并且抑制率随浓度的增加而增加。经大豆黄酮处理24 h后,CD133肿瘤干细胞的数量也显著减少。结论:大豆黄酮不仅具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,而且也具有抑制CD133肿瘤干细胞增殖的作用。     

肝癌干细胞表达与血管生成拟态形成的研究

目的研究肝癌血管生成拟态(VM)形成与肝癌干细胞的关系。方法在体外分别建立肝癌细胞株HCC97H、SMMC7721以及正常肝细胞L02三维培养,观察它们各自形成VM的能力。利用激光捕获显微切割技术分离出形成VM的肝癌细胞,RT-PCR和Western blot分别检测内皮相关分子VE-cadherin、CD31及肝癌干细胞标志物CD133和CD34表达水平。结果①HCC97H细胞在三维培养下形成VM;SMMC7721和正常肝细胞L02不形成VM;②激光捕获显微切割成功捕获目的细胞;③各组中VE-cadherin mRNA和蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05)。CD31在肝癌细胞中不表达。CD133 mRNA和CD34 mRNA在各组中表达差异有统计学意义(P<0.05);CD133和CD34蛋白在各组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论肝癌干细胞表达与肝癌细胞VM的形成有关。     

Research of the relationship between liver cancer stem cells and vasculogenic mimicry

目的 研究肝癌血管生成拟态(VM)形成与肝癌干细胞的关系.方法 在体外分别建立肝癌细胞株HCC97H、SMMC7721以及正常肝细胞L02三维培养,观察它们各自形成VM的能力.利用激光捕获显微切割技术分离出形成VM的肝癌细胞,RT-PCR和Western blot分别检测内皮相关分子VE-cadherin、CD31及肝癌干细胞标志物CD133和CD34表达水平.结果 ① HCC97H细胞在三维培养下形成VM; SMMC7721和正常肝细胞L02不形成VM;②激光捕获显微切割成功捕获目的 细胞;③各组中VE-cadherin mRNA和蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05).CD31在肝癌细胞中不表达.CD133 mRNA和CD34 mRNA在各组中表达差异有统计学意义(P＜0.05);CD133和CD34蛋白在各组间表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝癌干细胞表达与肝癌细胞VM的形成有关.     

金雀异黄素抑制肝癌干细胞样细胞的特性及对氟尿嘧啶耐药性的影响

目的：研究金雀异黄素对SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞特性以及氟尿嘧啶敏感性的影响。方法不同浓度金雀异黄素处理SMMC-7721细胞系球形成细胞。肿瘤球形成法检测自我更新能力。MTT比色法测定氟尿嘧啶药物敏感性。Western blot分析干细胞标志物CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表达。结果金雀异黄素显著抑制SMMC-7721细胞肿瘤球形成,并优先抑制球形成细胞增殖活性(P<0.05)。金雀异黄素(10μmol/L)有效逆转球形成细胞对氟尿嘧啶的耐药性。金雀异黄素降低CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表达水平。结论金雀异黄素抑制肝癌干细胞样细胞特性和氟尿嘧啶耐药性,其作用机制与抑制干细胞标志物蛋白表达和阻断Hedgehog信号传导有关。     

Notch 1信号通路对人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞的干细胞特性,初步探讨调控Notch 1信号通路对CD133+细胞亚群增殖和凋亡的影响.方法 流式分选和检测SMMC 7721细胞中的CD133+细胞.利用软琼脂集落实验及裸鼠成瘤实验验证CD133+细胞的干细胞特性.RT-PCR法检测CD133+细胞中Notch信号系统的表达;将分选出来的CD133+细胞分为激活组(加入Notch 1激活剂Jagged 1)、抑制组(加入Notch 1抑制剂DAPT)和空白对照组(加入PBS缓冲液),RT-PCR法检测3组细胞Hes-1基因的表达,MTT法和流式细胞仪检测各组细胞增殖能力和凋亡能力.结果 成功分选出CD133+亚群细胞;软琼脂集落实验和裸鼠成瘤实验表明CD133+细胞较CD133-细胞具有较强集落形成能力和体内成瘤能力;RT-PCR检测CD133+细胞中仅表达Notch 1/Jagged 1信号通路;激活组Hes-1表达强度增强,抑制组表达强度减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测激活组、抑制组和空白对照组吸光度值差异均有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测激活组总凋亡率大于空白对照组,反之,抑制组总凋亡率小于空白对照组,各组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133+细胞是人肝癌SMMC 7721细胞中干细胞标志物之一,Notch 1信号通路对CD133+细胞的增殖和凋亡发挥着重要作用.     

姜素对CD34~+肝癌SMMC-7721细胞增殖及CD34表达的影响

目的:探讨姜素对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及其CD34蛋白表达的影响。方法:培养人CD34+肝癌SMMC-7721细胞并用姜素处理,MTT法测定细胞增殖率,流式细胞术测定SMMC-7721细胞中CD34+细胞含量,Western blot法测定CD34蛋白的水平。结果:姜素对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率随姜素浓度和作用时间的增加而升高(P<0.05)。姜素处理组CD34+细胞的含量与正常组中CD34+细胞的含量差异具有统计学意义(P<0.05),且抑制率随浓度升高而升高。Western Blot检测CD34的表达情况,组内及组间条带灰度值比较:CD34的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:姜素能抑制人CD34+肝癌细胞的增殖,但对CD34蛋白的表达无影响。     

8-溴-7-甲氧基白杨素对Huh-7细胞系肝癌干细胞样细胞自我更新的影响

目的:研究8-溴-7-甲氧基白杨素(BrMC)抑制源自人肝细胞癌Huh-7细胞系细胞肿瘤球形成细胞即肝癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养人肝癌Huh-7细胞系细胞,干细胞条件培养基悬浮培养法富集和扩增LCSLCs。MTT比色法测定细胞活性;肿瘤球形成法检测自我更新能力;FITC-CD133标记FCM分析CD133表达。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6天,Huh-7细胞形成非粘附、三维生长的肝癌球体细胞即LCSLCs。与Huh-7细胞相比,BrMC抑制LCSLCs细胞活性作用更强(P<0.05),并以浓度依赖性方式减少肿瘤球数目(P<0.05),降低CD133蛋白表达(P<0.05)。结论:干细胞条件培养基悬浮培养能分离和富集LC-SLCs;BrMC具有抑制LCSLCs细胞自我更新能力作用,其作用机制与降低干细胞标记物CD133蛋白的表达相关。     

干扰素对肝癌细胞端粒酶活性及c—myc蛋白的影响

目的 观察干扰素－α对肝癌细胞SMMC－7721粒粒酶活性及c-myc蛋白的影响,进一步探讨干扰素抗癌治疗的作用机制。方法 利用干扰素－α处理人肝癌细胞SMMC－7221,然后使用TRAP方法观察处理前后粒酶活性的变化,同时利用免疫组化法测定c-myc蛋白的表达。结果 干扰素－α对肝癌细胞端粒酶活性有抑制作用,并且对c-myc蛋白的表达也有抑制作用,对c-myc表在的抑制出现在端粒酶活性抑制之前。结论 干扰素可能通过对c-myc表达的抑制端粒酶活性。     

卟啉氮芥对人肝癌细胞SMMC7721的光动力杀伤作用

目的：研究新单体化合物卟啉氮芥的光化疗抗肿瘤作用。方法：用结晶紫色法测定 啉氮芥对人肝癌细胞SMMC7721的光动力抑制效应。用测定培养上清乳酸脱氢酶（LDH）活性方法研究光动力作用对人肝癌细胞SMMC7721细胞膜的作用,用^3H-Td掺入法研究光动力作用对人肝癌细胞SMMC7721DNA合成的影响。结果：卟啉氮芥（5μg/ml,培养1h）可使人肝癌细胞SMMC7721D值明显降低、经光激发可使培养上清LDH活性显升高;可使体外培养从肝癌细胞SMMC7721的^3H-TdR掺入显下降,经光激发可使体外培养人肝癌细胞SMMC7721的^3H-TdR掺入量进一步显下降。结论：卟啉氮芥可显抑制人肝癌细胞SMMC7721DNA的合成;对人肝癌细胞SMMC7721有显的光动力抑制作用,轲破坏肿瘤细胞的细胞膜,抑制肿瘤细胞DNA的合成,提示卟啉氮芥对肿瘤细胞有显的光动力杀伤作用,具有发展为光化疗抗癌新药的前景。     

Estabishment of A Human Liver Cancer Cell Line Transfected with IL-2 cDNA and Its Biologic Activity

Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｄｕｃｅａｎｔｉ ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ ,ｓｃｉ ｅｎｔｉｓｔｓｓｉｎｃｅｌｏｎｇａｇｏｈａｖｅａｔｔｅｍｐｔｅｄｔｏｉｎｔｅ ｇｒａｔｅｃｅｌｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｎｔｏｔｕｍｏｒｃｅｌｌｖｉａｇｅ ｎｏｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｍａｋｅｉｔｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｅｘ ｐｒｅｓｓｌｏｃａｌｌｙ .ＩｎｔｈｉｓｓｕｒｖｅｙｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｃｅｌｌＳＭＭＣ 772 1ｗａｓｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒＬＮＣ ＩＬ2 .Ｔｈｅ…     

槲皮素对人肝癌细胞耐药株SMMC7721／VCR逆转作用的实验研究

目的探讨槲皮素（Que）对人肝癌细胞耐长春新碱（VCR）耐药株（SMMC7721／VCR）逆转作用的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析Que对人肝癌细胞敏感株（SMMC7721／S）、耐药株（SMMC7721／VCR）的抑制作用；Que与VCR联合作用时，SMMC7721／S对VCR的增敏作用及对SMMC7721／VCR耐药性的逆转作用。结果SMMC7721／S、SMMC7721／VCR对VCR的IC50值分别为（1．16±0．06）mg／L和（13．28±0．35）mg／L。SMMC7721／VCR对VCR耐药倍数为11．45倍。Que对两细胞株的生长有明显的抑制作用。25．0～50．0μmol／L终浓度的Que在体外能够明显提高SMMC7721／VCR对VCR的敏感性。结论Que能够部分逆转SMMC7721／VCR细胞的耐药性。它可作为有效的多药耐药逆转剂，与其它化疗药物联合应用于肿瘤的化学治疗。     

EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响

目的：探讨肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对EpCAM和CD13表达的影响.方法：Western blot检测正常肝细胞系（LO2细胞）和肝癌细胞系（Huh7,Bel-7404,Hep3B,QSG-7701细胞）中肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13的表达情况,同时建立稳定转染HBx基因的Bel-7404 （Bel-7404/HBx）细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测转染后EpCAM和CD13表达情况.结果：EpCAM和CD13在不同的肝癌细胞系中表达水平完全不同;转染HBx基因后EpCAM的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的（2.04±0.16）和（2.03±0.25）倍;而CD13的mRNA和蛋白表达水平明显下调,分别为对照组的（69±8）％和（55±7）％.结论：肝癌干细胞可能存在多个干细胞亚群,在不同的肝癌细胞中干细胞标记物的表达水平不同,而HBX对不同亚群的影响也不同.     

一氧化氮对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2生长增殖的影响

目的：应用两株人肝癌细胞（SMMC-7721和HepG2）为实验模型，以硝普钠（SNP）为NNO供体，探讨NO对人肝癌细胞生长增殖的影响。方法：应用MTT、荧光染色技术和电子显微技术、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术定性和定量地检测SMMC-7721和HepG2细胞凋亡情况。结果：NO供体SNP能抑制人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的生长增殖，并诱导其凋亡，在一定范围内呈时间-剂量依赖关系，同时也引起细胞坏死；SMMC-7721细胞对NO作用的敏感性较HepG2高。结论：NO可抑制人肝癌细胞生长增殖，诱导细胞凋亡，并引起死亡，且两株细胞对其敏感性不同。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

The role of NF-κB in hepatocellular carcinoma cell

Objective To evaluate the role of nuclear factor-kappaB (NF-κB) and IκBα in hepatocellular cacinoma (HCC) SMMC7721 cells, the consequence of NF-κB inhibition in SMMC7721 cells transfected with mutated IκBα (mIκBα) plasmid and the effect of stable inhibition of NF-κB activity in combination with Doxorubicin.Methods Western blot was used to determine the expression of NF-κB and IκBα in SMMC7721 cells and normal liver cells. Nuclear protein was used to evaluate the binding of the 32P-labeled tandem κB sequence using electrophoretic mobility shift assay and the expression of NF-κB using Western blot between SMMC7721 cells transfected with mIκBα plasmid (SMMC7721-MT) and control cells. Furthermore, cell viability was plotted between SMMC7721-MT and control cells. The binding of κB sequence and cell viability between SMMC7721-MT and control cells at different concentrations of Doxorubicin were also investigated.Results Western blot analysis for nuclear extract showed more P50 (NF-κB1) and P65 (RelA) expression in SMMC7721 cells compared with normal liver cells. The expression of cytosolic IκBα protein in SMMC7721 cells was less than that in normal cells. SMMC7721-MT cells inhibited NF-κB nuclear translocation at 0, 24, 48 and 96 hours. Furthermore, NF-κB cannot be detected in the nuclear protein of SMMC7721-MT cells by Western blot. By calculating cell viability, the proliferation of SMMC7721-MT cells was shown to be suppressed more significantly than that of control cells. NF-κB in untransfected cells was activated by Doxorubicin in a dose-dependent manner, but that in SMMC7721-MT cells was not induced at low concentrations of Doxorubicin. Compared with untransfected cells, the viability of SMMC7721-MT cells was significantly suppressed at the same concentration of Doxorubicin (P&lt;0.01）.Conclusions The present study demonstrates that upregulation of NF-κB and downregulation of inhibitory kappaB (IκBα) in SMMC7721 cells are related with the growth of hepatocellular cacinoma cells. Stable expression of mIκBα in SMMC7721-MT cells can inhibit NF-κB nuclear translocation and suppress cell growth. Furthermore, stable inhibition of NF-κB activity in combination with Doxorubicin can significantly inhibit cell proliferation in SMMC7721-MT cells. Thus, modulation of NF-κB may represent an improvement in the efficacy of HCC therapies and be worthy of further research and investigation.     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。