HL60/VCR白血病细胞多药耐药机制的初步探讨

目的探讨白血病细胞产生耐药的机制,以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用。方法采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系,MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性;RT-PCR检测诱导前后mdr1、MRP、TopoⅡα、GSTπ和VEGF mRNA的表达情况。结果诱导后的HL60/VCR耐药细胞不仅对VCR高度耐药,对其他类化疗药物亦具有交叉耐药性;与HL60相比,HL60/VCR的mdr1、TopoⅡα和VEGF mRNA的表达明显增强,GSTπmRNA的表达无明显变化;HL60和HL60/VCR均不表达MRP mRNA。结论耐药基因mdr1和TopoⅡα以及VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。     

Bcl—XL在白血病多药耐药细胞株HL60／VCR中的表达及意义

0引自BCI－X。是新近被证实的bCI－2基因家族成员之一，其结构和功能与bC人2相似，可抑制细胞凋亡D‘．关于它与多药耐药（MDR）关系的研究越来越受到重视［’j．我们采用SABC免疫组化和Westernblot方法检测敏感细胞HL60和耐药细胞HI．60／VCR的Bcl－XL表达，以初步探讨Bcl－X。与白血病MDR形成的关系．回方法1．l细胞林和试剂HL60敏感细胞株为上海细胞生物所提供；HL60／VCR耐药细胞株来源于美国纽约MemorialSloan－Kett，ringCancerCenter，在含200pg／L长春花碱（VCR）的RPMI1640培养液中传代，无VCR培养液培养2Wb…     

A549肺腺癌细胞株BALB/C-nu/nu裸鼠骨转移模型的建立

目的 探讨A549肺腺癌细胞株裸鼠骨转移模型建立的可行性.方法 选择健康6～8周龄Balb/c-nu/nu裸鼠20只,将20只Balb/c-nu/nu裸鼠采用经皮左心室内注射法,将A549肺腺癌细胞株接种于裸鼠体内,接种后饲养观察Balb/c-nu/nu裸鼠的成瘤情况.结果 全部裸鼠均完成经皮心脏肺腺癌细胞的种植,共造模成功12只,占到全部裸鼠的60％.造模成功的裸鼠成瘤天数经SPSS分析,结果符合正态分布,得出裸鼠成瘤天数的均值、标准差、及可信区间.结论 通过经皮左心室内注射A549肺腺癌细胞株,建立Balb/c-nu/nu裸鼠肺腺癌骨转移模型,方法可行性强,科学可靠,成膜率高,可用于肺腺癌骨转移发病机制的研究.     

P388 / VCR 耐药细胞株裸鼠腹水瘤模型的建立

目的 建立P388/VCR细胞白血病多药耐药动物模型,为白血病耐药机制的研究及筛选有效逆转白血病多药耐药的药物奠定基础.方法 体外培养P388/VCR细胞,分别取对数生长的白血病细胞,在无菌条件下给裸鼠腹腔直接接种2.5×107 个/mL、1×107个/mL、5×106 个/mL细胞,0.2 mL/只,观察肿瘤、腹水的形成情况,收集腹水离心制成细胞悬液,检测其耐药倍数;并采取裸鼠外周血、腹水及胸骨骨髓涂片,吉姆萨染色,显微镜下观察细胞形态,按细胞形态计算白血病细胞百分比,了解肿瘤细胞的浸润情况.结果 （1）裸鼠腹腔注射P388/VCR耐药细胞量分别为2.5×107个/mL、1×107 个/mL、5×106 个/mL,其瘤块形成率分别为100％、100％、83.3％,平均形成天数分别是6.17 d、9.08 d、10.42 d,腹水形成率均为100％,平均形成腹水时间分别是5.42 d、6.58 d、8.25 d,接种细胞后平均存活时间分别是14 d、17.17 d、18.42 d;（2）MTT法测定体外培养P388/VCR细胞及其移植腹水瘤细胞的耐药倍数分别为7.6倍与5.7倍;（3）外周血、腹水及胸骨骨髓涂片均有白血病细胞浸润,每张涂片均有有核细胞且大于200个.结论 以P388/VCR细胞建立的裸鼠耐药腹水瘤模型,裸鼠外周血、腹水及骨髓全部被白血病细胞所浸润,且仍保持近似体外的耐药活性,为耐药机制和逆转研究提供了良好的体内模型.     

A549肺腺癌细胞株BALB/C- nu/nu裸鼠骨转移模型的建立

［摘要］ 目的　探讨A549肺腺癌细胞株裸鼠骨转移模型建立的可行性．方法　选择健康6～8周龄Balb/c-nu/nu 裸鼠20只,将20只Balb/c-nu/nu 裸鼠采用经皮左心室内注射法,将A549肺腺癌细胞株接种于裸鼠体内,接种后饲养观察Balb/c-nu/nu 裸鼠的成瘤情况．结果　全部裸鼠均完成经皮心脏肺腺癌细胞的种植,共造模成功12只,占到全部裸鼠的60%．造模成功的裸鼠成瘤天数经SPSS分析,结果符合正态分布,得出裸鼠成瘤天数的均值、标准差、及可信区间．结论　通过经皮左心室内注射A549肺腺癌细胞株,建立Balb/c-nu/nu裸鼠肺腺癌骨转移模型,方法可行性强,科学可靠,成膜率高,可用于肺腺癌骨转移发病机制的研究．     

解毒化瘀药对白血病HL60/ADR耐药细胞凋亡影响的研究

目的:探讨解毒化瘀药含药血清对白血病HL60/ADR耐药细胞凋亡的影响.方法:应用流式细胞仪检测解毒化疼药含药血清处理后的各组HL60/ADR细胞凋亡的情况.结果:解毒化瘀药中药复方能促进白血病耐药细胞HL60/ADR早期凋亡率,并呈浓度相关性.结论:解毒化瘀药含药血清能够促进HL60/ADR细胞凋亡.     

HL－60和抗分化HL－60细胞的基本生物学和细胞遗传学特征比较

对本实验室克隆的人急性早幼粒白血病细胞株ＨＬ－６０及其抗维甲酸分化亚系ＨＬ－６０／ＲＡ进行细胞增殖、细胞周期、分裂中期细胞染色体分布和Ｇ－显带核型分析。发现两者在倍增时间和细胞形态上基本一致。在细胞周期分布上，两者都具有肿瘤细胞的周期分布特征，但ＨＬ－６０／ＲＡ细胞的Ｓ期细胞群少于ＨＬ－６０细胞。两者染色体数量分布比较集中，染色体众数分别为４５±３（ＨＬ－６０）和４５±１（ＨＬ－６０／ＲＡ），呈近二倍体核型，Ｇ－显带核型分析表明两者都接近正常二倍体核型，都含较多的异常染色体。上述结果说明ＨＬ－６０和ＨＬ－６０／ＲＡ细胞的遗传学来源一致。     

补骨脂素对HL60/HT耐药细胞的逆转作用及对细胞内钙离子浓度的影响

目的研究补骨脂素对HL60/HT耐药细胞的逆转作用及对耐药细胞内Ca2 浓度的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用MTT法测定补骨脂素对细胞增殖的抑制作用,高效液相色谱法检测细胞内三尖杉酯碱(HT)的量,激光共聚焦显微镜测定细胞内不同时段和不同时间点的Ca2 浓度。结果补骨脂素在1~20μmol/L能不同程度降低HT对HL60/HT细胞的IC50,并不同程度提高细胞内HT的量;1~20μmol/L补骨脂素作用不同时段(24、48、96h),HL60/HT细胞内Ca2 浓度与作用时间成负相关,10和20μmol/L补骨脂素作用HL60/HT不同时间(5、10、15、20、25min),细胞内Ca2 浓度与作用成负相关性。结论补骨脂素能逆转HL60/HT细胞的多药耐药,其作用机制与影响耐药细胞内Ca2 浓度、增加细胞内HT的量有关。     

LY294002对SGC7901/VCR细胞VCR耐药逆转作用研究

目的观察LY294002对SGC7901/VCR胃癌细胞长春新碱(VCR)耐药的逆转作用,并探讨其可能机制。方法通过MTT法明确LY294002可以逆转SGC7901/VCR对VCR的耐药作用后,采用TUNEL检测细胞的凋亡,高效液相法检测细胞内药物浓度,RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞中MDR1、caspase-3和XIAP的基因和蛋白表达水平。结果 LY294002能明显提高VCR的诱导细胞凋亡作用,明显增加细胞内VCR的浓度,并可降低耐药细胞中MDR1、XIAP的基因和升高caspase-3表达水平。结论抑制PI3K/PKB通路可逆转胃癌耐药,其机制可能与降低耐药基因MDR1的表达以及调控凋亡相关基因caspase-3和XIAP的表达有关。     

BALB/c-nu/nu裸鼠造血微环境损伤模型的建立

目的 构建适合移植使用的BALB/c-nu/nu裸鼠造血微环境损伤模型.方法 分别用3.0、4.0、5.0、6.0、7.0Gv剂量辐照BALB/c-nu/nu裸鼠,检测照射后1、3、5、7、14、21 d血象变化,检测照射后1、7、14、21 d基质细胞集落形成单位(CFU-F)和巨核细胞计数,观察照射后骨髓组织活检变化情况.结果 7.0 Gy辐照剂量照射后裸鼠全部死亡;6.0 Gy组照射后出现明显骨髓抑制,至照射后21 d不能恢复至照射前水平,且部分裸鼠照射后死亡;3.0、4.0 Gy照射后裸鼠仅出现轻度骨髓抑制;5.0 Gy组照射后出现明显骨髓抑制,未做特殊处理于照射后21 d自行恢复至照射前水平.不同剂量放射线照射后裸鼠CFU-F计数变化不同.3.0 Gy和4.0 Gy组CFU-F在照射后7～14 d 出现轻度减少,6.0 Gy组照射后CFU-F明显减少,至照射后21 d不能恢复,5.0 Gy组照射后CFU-F也出现了较明显减少,但在照射后21 d恢复至照射前水平.结论 5.0 Gy是BALB、/c-nu/nu裸鼠造血微环境损伤模型的适宜照射剂量.     

反义bcl─2RNA促进HL─60细胞的凋亡

目的：分析反义ｂｃｌ－２对ＨＬ－６０细胞凋亡的作用，为进一步研究凋亡机制打基础．方法：我们用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将插有反义ｂｃｌ－２基因片段的重组逆转病毒载体ｐＤＯＲ－ＡＢ转染ＨＬ－６０细胞，用核酸打点杂交方法检测转染效果和载体表达效果，用流式细胞仪检测ｂｃｌ－２的改变及细胞周期的变化，用光镜和电镜观察转染细胞的形态学改变，并用转染的细胞对足叶乙甙敏感性的变化间接证明反义ｂｃｌ－２的作用．结果：ｐＤＯＲ－ＡＢ转入ＨＬ－６０细胞并表达ｂｃｌ－２反义ＲＮＡ；细胞内Ｂｃｌ－２蛋白含量明显下降；细胞周期分析可见凋亡峰；电镜下可见凋亡细胞；ＤＮＡ凝胶电泳出现梯状电泳带．结论：反义ｂｃｌ－２瞬时表达可促进ＨＬ－６０细胞的凋亡，ｂｃｌ－２在ＨＬ－６０细胞凋亡的调节中起重要作用     

耐长春新碱肝癌细胞系HCC-7721/VCR的建立

目的: 培养建立耐长春新碱肝癌细胞系HCC-7721/VCR,并对其生物学特性进行研究.方法: 应用人肝癌细胞系HCC-7721,采用长春新碱大剂量间歇诱导法,建立耐药人肝癌细胞系HCC-7721/VCR.观察该细胞的生长规律;用MTT法鉴定该耐药细胞模型对多种抗癌药物的多药耐药性;以流式细胞技术检测该耐药细胞模型细胞周期分布.结果: 经MTT法鉴定,HCC-7721/VCR细胞较HCC-7721细胞的长春新碱半数致死浓度(IC50)增大了4.15倍,并对多种化疗药物产生耐药性,其耐药性提高了2～4倍不等;耐药细胞倍增时间明显延长,S期细胞减少,而G1、G2期细胞增多.结论: HCC-7721/VCR是一个明确的多药耐药细胞模型,具有耐药细胞的基本生物学特性.     

神经节苷脂GM_3诱导HL-60细胞分化后中性糖脂的变化

为了研究神经节苷脂ＧＭ３（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ，ＧＭ３）对人早幼粒白血病细胞系ＨＬ６０细胞诱导分化后中性糖脂的影响，将神经节苷脂ＧＭ３加到ＨＬ６０细胞的ＤＭＥ／Ｆ１２培养液中，观察其对ＨＬ６０细胞的诱导分化作用及分化后细胞中性糖脂的变化。结果：细胞吞噬功能显著增强，非特异性酯酶活性升高，细胞形态也呈现与这种分化相一致的改变。神经节苷脂ＧＭ３诱导ＨＬ６０细胞分化后细胞中性糖脂各组分的百分含量发生了显著改变，ＣＤＨ、ＣＭＨ及ＣＱＨ显著增多，与分化前相比Ｐ＜００５；ＣＸＨ显著降低，与分化前相比Ｐ＜００５。结果提示：神经节苷脂ＧＭ３诱导ＨＬ６０细胞分化时改变了细胞中性糖脂的代谢     

蟾酥注射液逆转HL60/阿霉素细胞多药耐药的机制

目的探讨蟾酥注射液(CHS)对人类白细胞多药耐药细胞系HL60/阿霉素细胞的逆转作用机制。方法 MTT法测定CHS预作用后HL60/阿霉素细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞术考察CHS对HL60/阿霉素细胞周期的影响;免疫组化考察CHS对HL60/阿霉素细胞NF-κB、MRP、GST-π、iNOS蛋白表达的调节作用。结果 CHS可将阿霉素对HL60/阿霉素细胞的IC50值由34.1971μmol/L降至17.4393μmol/L,逆转倍数为1.9609倍;FCM显示CHS作用后HL60/阿霉素阻滞于G0/G1期、G2/M期,降低进入S期比例,并出现凋亡峰;免疫组化结果显示,CHS能下调HL60/阿霉素细胞中MRP、GST-π表达,上调NF-κB、iNOS的表达。结论蟾蜍注射液逆转HL60/阿霉素细胞的多药耐药性可能是通过下调MRP、GST-π的表达,上调NF-κB、iNOS的表达,促进HL60/阿霉素细胞凋亡,从而增加HL60/阿霉素细胞对药物的敏感性。     

Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in K562/VCR vincristine-resistant leukemia cell line

ObjectiveTo probe insights into the reversal effect of bufalin on vincristine-acquired multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562/VCR.MethodsProliferative inhibition rate and the reversal index (RI) of bufalin were determined by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The uptake of Adriamycin (ADM) in K562/VCR cells, cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM). Cell morphologic changes were observed with Wright-Giemsa staining. The expression of P-glycoprotein (P-gp), multidrug-associated protein-1 (MRP1), Bcl-xL and Bax protein were measured by immunocytochemistry.ResultsThe human leukemia multidrug resistant K562/VCR cells showed no cross-resistance to bufalin. The RIs of bufalin at concentrations of 0.0002, 0.001 and 0.005 μmol/L were 4.85, 6.94 and 14.77, respectively. Preincubation of 0.001 μmol/L bufalin for 2 h could increase intracellular ADM fluorescence intensity to 28.07% (P<0.05) and down-regulate MRP1 expression simultaneously, but no remarkable effect was found on P-gp protein. Cell cycle analysis indicated increased apoptosis rate and apparent decreased G2/M phase proportion after treatment with bufalin. When exposed to 0.01 μmol/L bufalin, typical morphological changes of apoptosis could be observed. Down-regulation of Bcl-xL and up-regulation of Bax expression in K562/VCR cells could be detected by immunocytochemistry.ConclusionBufalin could partly reverse the MDR of K562/VCR cells, with a possible mechanism of down-regulating MRP1 expression and activating apoptosis pathway by altering Bcl-xL/Bax ratio.     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞株HL60凋亡的机制研究

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞HL60凋亡的机制。方法 四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Hoechst33342染色形态学观察及流式细胞仪证实细胞凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）、Caspase-9、Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）蛋白表达。结果 硼替佐米对HL60细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖关系,30nmol/L的硼替佐米作用24h能明显抑制HL60细胞增殖,抑制率为76％,形态学观察可见明显的胞核凝聚、固缩及碎裂;流式细胞仪检测可见明显的凋亡峰凋亡率为62．6％;Western印迹检测显示Bcl-2表达下降,Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白均裂解激活。结论 硼替佐米能诱导髓系白血病细胞HL60凋亡,其机制与Bcl-2蛋白的抑制及Caspase凋亡信号途径的激活有关。     

GM-CSF耦联米托蒽醌脂质体的制备及体外抑瘤作用的实验研究

目的 制备粒-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)耦联米托蒽醌脂质体(liposome-entrapped mitoxantrone,LEM),比较其与LEM和米托蒽醌(dihydroxyanthraquinone,DHAQ)对HL60/ADM细胞的体外杀伤作用.方法 用逆向蒸发法制备LEM,高速离心法纯化LEM,比色法测定包封率,透射电镜下观察LEM的结构和粒径,以戊二醛交联法制备出LEM-GM-CSF,紫外分光光度法测定耦联率,流式细胞术测定LEM-GM-CSF中GM-CSF的活性保留率.通过MTT法检测所制备LEM-GM-CSF 、LEM 及DHAQ对HL60/ADM细胞的杀伤作用.结果 LEM粒径分布均匀,为170～220 nm,包封率为80%,GM-CSF与LEM有较高的耦联率及活性保留率,分别为42.3%及74.6%;LEM-GM-CSF 、LEM 及DHAQ对HL60/ADM细胞具有杀伤作用,且LEM-GM-CSF的杀伤作用显著强于LEM和DHAQ.LEM-GM-CSF、LEM及DHAQ对HL60/ADM细胞作用24 h的IC50分别是8.73、12.42、27.31 μg/ml;作用48 h的IC50分别是:0.62、8.25、12.44 μg/ml.结论 本研究制备的LEM-GM-CSF对 HL60/ ADM细胞具有明显的杀伤作用,有望成为良好的抗白血病药物新剂型.