金雀异黄素抑制氯化钴诱导的人视网膜色素上皮细胞缺氧诱导因子1α表达的研究

目的：研究氯化钴(CoCl2)诱导体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达以及金雀异黄素(Gen)对其表达的影响。方法：采用免疫组化和激光共聚焦显微镜研究HIF-1α的表达。结果：CoCl2可明显诱导人RPE细胞HIF-lα的表达，0．5h达高峰，随后逐渐下降。Gen可呈浓度依赖性地抑制氯化钴诱导的HIF-1α蛋白表达。结论：Gen可抑制CoCl2诱导的人RPE细胞HIF-1α蛋白表达。     

Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立

目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。     

稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立

目的建立能够稳定表达人G250基因的renca细胞株。方法采用PCR扩增出人G250基因编码区长度的互补序列,根据DNA重组技术定向插入到pIRES-neo真核表达载体中,得到重组表达质粒pIRES-neo-G250。用阳离子脂质体介导法将该质粒稳定转染到renca小鼠细胞中,通过调整G418的浓度筛选出阳性的克隆,蛋白免疫印迹和免疫荧光测试验证人G250基因转染小鼠renca细胞株后的表达情况。结果经过限制性内切酶鉴定和序列分析发现pIRES-neo-G250重组质粒构建正确,蛋白免疫印迹结果表明,可以从稳定转染pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞中检测到G250的蛋白条带,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果表明,稳定转染pIRES-neo-G250的renca细胞用人的G250特异性抗体检测到有高效的荧光表达。结论成功建立了稳定、高效表达pIRES-neo-G250分子的人G250基因renca细胞株,为后续的肾癌疫苗研究奠定了基础。     

肿瘤坏死因子︿对肠上皮细胞核因子B的活化与细胞因子表达的影响

目的　探讨炎症状态时肠上皮细胞核因子 κB的活化对肠上皮细胞分泌促炎细胞因子的调节作用。方法　将 TNF-α(10 ng/m l)加入培养的结肠癌上皮细胞系 H2 9细胞中 ,3h后收集上清液 ,EL ISA法测 IL - 8;分别提取细胞核蛋白、m RNA,经 Western blotting检测核因子 NF- κB P6 5的活化 ,PT- PCR检测 IL- 8的表达。结果　对照组的 HT2 9细胞低表达 IL - 8m RNA,细胞核中很难检测出 NF-κB P6 5 ,细胞培养液中 IL - 8的质量浓度为 172ng/L。经 TNF- α刺激后 ,HT2 9细胞高表达 IL- 8m RNA。核蛋白 NF- κB P6 5表达明显增高 ,细胞培养液中 IL- 8的质量浓度为 6 39ng/L ,明显高于对照组 (P<0 .0 1)。结论　炎症状态时 ,核因子κB的活化促进肠上皮细胞分泌促炎细胞因子 ,调节肠上皮细胞参与炎症反应     

肿瘤坏死因子α对肠上皮细胞核因子κB的活化与细胞因子表达的影响

目的探讨炎症状态时肠上皮细胞核因子κB的活化对肠上皮细胞分泌促炎细胞因子的调节作用.方法将TNF-α(10 ng/ml)加入培养的结肠癌上皮细胞系H29细胞中,3 h后收集上清液,ELISA法测IL-8;分别提取细胞核蛋白、mRNA,经Western blotting检测核因子NF-κB P65的活化,PT-PCR检测IL-8的表达.结果对照组的HT29细胞低表达IL-8 mRNA,细胞核中很难检测出NF-κB P65,细胞培养液中IL-8的质量浓度为172 ng/L.经TNF-α刺激后,HT29细胞高表达IL-8 mRNA.核蛋白NF-κB P65表达明显增高,细胞培养液中IL-8的质量浓度为639 ng/L,明显高于对照组(P＜0.01). 结论炎症状态时,核因子κB的活化促进肠上皮细胞分泌促炎细胞因子,调节肠上皮细胞参与炎症反应.     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

番泻叶提取物对人肠上皮细胞生物学特性的影响

［兰梅，王新，吴汉平，樊代明. 世界化人消化杂志，2001；9(5):555-559］ 目的研究番泻叶提取对人肠上皮细胞生物学特性的影响. 方法应用MTT法观察番泻叶提取特对体外培养人肠上皮细胞生长的影响. 用流式细胞术观察番泻叶提取物(5 g*L-1)作6 wk后细胞增殖周期的变化，并用光镜和透射电镜观察长期番泻叶提取物作用下细胞形态学的变化. 细果大剂量番泻叶提取物(>25 g*L-1)可致体外培养的人肠上皮细胞全部死亡. 中等剂量(5 g*L-1)明显抑制细胞的生长(P<0.0001)，且呈剂量依赖关系，其IC50为7 g*L-1；小剂量(0.5 g*L-1)对细胞的生长无明显影响(P>0.05). 用番泻叶提取物(5 g*L-1)持续作用细胞6 wk后，可见其S期细胞数减少G2期细胞数增加，DI增高为1.11；光镜下见细胞贴壁差，生长缓慢，胞质中中毒颗粒增多；电镜下见细胞有明显空泡变性，凋亡细胞及凋亡小体多见，偶见病理性核分裂相. 结论番泻叶提取物对人肠上皮细胞生长的影响呈剂量依赖性，大剂量可致细胞生长延缓或死亡，小剂量无明显影响. 长期使用番泻叶提取物可使细胞增殖减慢，凋亡增加，异倍体DNA含量升高，促使细胞发生恶性转化. (何扬举)     

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的影响

目的：观察过氧化氢处理对体外培养肠上皮细胞株SW－480线粒体编码基因mRNA的影响。方法：以400μmol/L和4mmol/L的过氧化氢处理人肠上皮细胞细胞株（SW－480)3h后，分离RNA,应用RT－PCR检测ATPase6、ATPase8、COI、COII及COIII mRNA的变化。结果：过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的表达具有明显影响，但是这种改变不与过氧化氢的剂量呈现出一种一致的变化。结论：过氧化氢引起肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的明显改变。     

C－myc基因外显子1导入并稳定高效表达的细胞株的建立

将ｃ－ｍｙｃ外显子１的ＤＮＡ片段，插入带有ｎｅｏ基因的真核细胞表达载体ｐＲＣ／ＣＭＶ，运用电穿孔基因导入法将此构建好的重组质粒导入Ｈｅｌａ细胞。在抗Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的Ｈｅｌ３细胞抽提物中经免疫印迹技术检测，发现一条分子量约为３２ＫＤ的蛋白带，从而实现了ｃ－ｍｙｃ外显子１在真核细胞中高效、稳定地表达，为进一步研究ｃ－ｍｙｃ外显子１的生理功能打下基础。     

硫酸右旋糖酐抑制人胃癌腹腔种植转移及其对缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的 探讨硫酸右旋糖酐(DS)是否可抑制胃癌腹腔种植转移及其对缺氧诱导因子-1α(Hif-1α)表达的影响.方法 裸鼠72只分为两大组,对照组32只,实验组40只,培养BGC-823胃癌细胞,腹腔注射建立裸鼠腹腔种植转移动物模型.注射胃癌细胞1d后,对照组注射生理盐水1 mL,实验组注射0.3％DS 1 mL.于1、3、7、14d时剖腹观察胃癌细胞腹腔种植转移情况,采用逆转录PCR(RT-PCR)及免疫组织化学检测缺氧诱导因子(Hif-1α) mRNA及蛋白的表达.结果 第7、14天实验组瘤结节数明显少于对照组.经RT-PCR及免疫组织化学检测,第3、7、14天实验组Hif-1α mRNA及蛋白的表达明显低于对照组(P＜0.05).结论 DS可以抑制胃癌的腹腔种植转移,DS可能是通过下调Hif-1α的表达来抑制胃癌的腹腔种植转移.     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达

目的 检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素-2(hBD-2)基因的激活作用及其活性组分．方法 应用遵转录聚合膏链反应(RT—PCR)法和Northern杂交检测HT-29细胞hBD-2mRNA的表达；采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞璧蛋白质成分．结果 RT—PCR和Northern杂交分析显示，在正常培养条件下HT-29细胞无可见的hBD-2mRNA表达信号，但在双歧杆菌菌体、细胞璧和胞璧蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2mRNA表达．结论 双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因的表达。双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性成分。     

烧伤大鼠血清对肠上皮细胞E-钙粘附蛋白表达的影响

目的　探讨烧伤血清对肠上皮细胞 E-钙粘附蛋白 (ECD)表达的影响及其意义。方法　培养大鼠肠上皮细胞株 IEC- 6 ;采用激光共聚焦及流式细胞术定量分析等技术 ,动态观察烧伤血清刺激培养的 IEC- 6细胞ECD的变化。结果　肠上皮细胞经烧伤血清作用后早期 ECD表达呈进行性下降 ,细胞通透性增加。结论　烧伤后肠上皮细胞细胞 ECD表达降低 ,细胞粘附连接损伤     

人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定

目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体（hCD123 CDS-pEGFP-N1）;经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为（97.94±1.93）%和（2.84±1.35）%,差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。     

人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定

目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体(hCD123 CDS-pEGFP-N1);经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为(97.94±1.93)%和(2.84±1.35)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。     

人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立

目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.     

烧伤大鼠血清对肠上皮细胞E—钙粘附蛋白表达的影响

目的：探讨烧伤血清对肠上皮细胞E－钙粘附蛋白（ECD）表达的影响及其意义。方法：培养大鼠肠上皮细胞株IEC－6；采用激光共聚焦及流式细胞术定量分析等技术，动态观察烧伤血清刺激培养的IEC－6细胞ECD的变化。结果：肠上皮细胞经烧伤血清作用后早期ECD表达呈进行性下降，细胞通透性增加。结论：烧伤后肠上皮细胞细胞ECD表达降低，细胞粘附连接损伤。     

稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系.方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段.用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1( ),构建真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:扩增出MCHR2的全长cDNA)成功构建pcDNA3.1( )MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株.结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础.     

人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达

[目的]为研究canstatin对动脉粥样硬化斑块的稳定作用,克隆人canstatin基因,并在COS7细胞中表达出具有生物活性的canstatin.[方法]利用RT-PCR技术,从人脐静脉血管内皮细胞中扩增canstatincDNA,并定向克隆入真核表达载体pSecTag2C中.用脂质体转染法,将重组质粒pSecTag2C-canstatin转入COS7细胞.培养48h后,对转化的COS7细胞行PCR和Western-blot鉴定,用MTT法检测canstatin对人脐静脉血管内皮细胞增殖的抑制作用.[结果]从人脐静脉血管内皮细胞中扩增出canstatincDNA片段.测序结果显示,克隆的canstatincDNA长684bp,序列与文献报道一致.从pSecTag2C-canstatin转化的COS7细胞中能特异地扩增出canstatin基因片段,Western-blot结果显示,转化的COS7细胞中有特异的34kDa的canstatin表达.MTT检测显示,表达canstatin的COS7细胞上清能呈剂量依赖性地抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖.[结论]构建了真核表达重组质粒pSecTag2C-canstatin,在COS7中表达出具有生物活性的人canstatin.     

人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的 :建立稳定表达人胰岛素样生长因子 - 1 ( h IGF- 1 )的细胞株。方法 :用脂质体转染法将含有 h IGF- 1 c DNA的真核表达载体转染 BHK细胞 ,经 G41 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养4周 ,进行原位杂交和免疫细胞化学检测。结果 :原位杂交检测在转染细胞的胞浆中有棕黄色颗粒样阳性杂交信号 ;免疫细胞化学检测在转染细胞的胞浆中有氯化镍蓝色阳性信号。结论 :G41 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,继续培养 4周 ,原位杂交和免疫细胞化学检测表明 h IGF- 1基因得到稳定表达