High-level Expression and Purification of Human Zona Pellucida huZP3a^22-176 and huZP3b^177-348 Peptides in Escherichia coli

Objective To try making huZP3a^22-176 and huZP3b^177-348 polypeptides （representing an intact huZP^322-348 protein without its N-terminal signal peptide and C-terminal transmembrane domain ） express in E. coli at a higher level Methods The cDNAs encoding huZP3a and huZP3b were obtained with PCR method. The pBV221 plasmid was used to construct thermo-inducible recombinant expression vector. Purification of two target expression products employed an improved method of preparative gel polyacrylamide gel electrophoresis. Results Two polypeptides of recombinant huZP3a （rhuZP3a） and recombinant huZP3b （rhuZP3b） were all expressed respectively in an E. coli BL21（DE3）pLysS strain at a higher level, which were recognized by two specific polyclonal antisera in Western blotting test which recognize a linear B cell epitope present in rhuZP3a or rhuZP3b respectively. Using the shake-flask method, approximately 5 mg of rhuZP3a and rhuZP3b with more than 95% relative homogeneity were harvested from 1 L culture respectively. Conclusion The availability of two rhuZP3 polypeptides will help in detecting the immunogenicities of rhuZP3a and rhuZP3b through animal experiments and confirming the function domain of non-glycosylated huZP3 to induce acrosome reaction in vitro.     

EFFECT OF 764-3 ON AGGREGATION AND CALCIUM MOVEMENTS IN AEQUORIN-LOADED HUMAN PLATELETS

Washed human platelets were roaded with the Ca^2 -sensitive photoprotein, oequorin, using hypoosmotic shock treatment technique. Then aggregarion and cytoplasmic ionized calcium concentration ([Ca^2 ]i) changes in response to collagen or thrombin were measured simultaneously in the aequorin-loaded human plarelets vrith a Platelet Ionized Calcium Aggregometer. 764-3, an active component isolated from the Chinest medicinal herb Salvia Milttorrhtza Bge, inhibited platelet [Ca^2 [i rise as well as aggregation evoked by collagen or thrombin in the presence of extracellular Ca^2 , After the extracellular Ca^2 was removed by addition of EGTA, collagen or thrombin, causing no aggregation, still elicited platelet [Ca^2 ]i rise which refletted Ca^2 mobilization from intraplatelet stores. Under this condition, 764-3 could also suppres splatelet [Ca^2 ]i rise. Analysis shows that 764-3 inhibits platelet Ca^2 influx and Ca^2 mobilization with similar potency, which accounts for its suppression of platelet [Ca^2 ]i rise, and must contribute to its inhibition of platelet aggregation.     

蛋白激酶C调节的1,4,5-三磷酸肌醇受体磷酸化在胆囊收缩素介导的胃窦平滑肌细胞钙动员中的作用

目的研究八肽胆囊收缩素（CCK-8）对大鼠胃窦平滑肌细胞（SMC）胞内钙释放和胞外钙内流的作用及对其具体相关机制的探讨。方法（1）多导生理记录仪记录大鼠离体胃窦肌条在不同条件下的收缩活动;（2）免疫印迹法和免疫沉淀法检测胃窦SMC的三型1,4,5-三磷酸肌醇受体（InsP3113）及其磷酸化水平;（3）Fura-2／AM标记胃窦SMC,观察CCK-8S对胞内钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响;（4）全细胞膜片钳检测胃窦SMC的L-型电压门控钙通道电流（ICa-L）的变化情况。结果（1）CCK-8S作用下胃窦肌条收缩幅值和频率改变明显[增长率分别为（62±13）％和（58±17）％,均P〈0．01],可被CCK-A受体拮抗剂和钙泵抑制剂所阻断;（2）蛋白激酶C（PKC）上调InsP3R3磷酸化水平,抑制CCK-8S介导的内钙释放;（3）CCK-8S引起的[Ca^2＋]i显著升高[从（69±7）mol／L升至（472±36）nmol／L,P〈0．01]分别可被CCK-A受体或胞内钙泵抑制剂和PKC激动剂所阻断;去除外钙或给予L-型钙通道阻滞剂时CCK-8S仍可引起[Ca^2＋]i升高;（4）CCK-8S显著增强胃窦SMC的IICa-t。[从（-56±7）pA升至（-89±6）pA,P〈0．01],可分别被ICa-L阻滞剂、胞内钙泵抑制剂和钙依赖性氯通道阻滞剂所阻断。结论CCK-8S引起的大鼠胃窦SMC的[Ca^2＋]i升高依赖于PKC介导的InsP3R3磷酸化作用调节下的细胞内钙离子释放。胞内钙释放可激活ICl-Ca,引起细胞膜去极化而活化ICa-L引起胞外钙内流,最终引起SMC收缩效应。     

WIN 55,212-2对培养的大鼠三叉神经节神经元胞内游离钙离子浓度的影响

目的检测WIN55，212—2对培养的大鼠三叉神经节神经元细胞内钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响并探讨其机制。方法以Fura一2／AM为钙探针，用细胞内双波长钙荧光系统检测细胞[Ca^2＋]i的变化。结果WIN55，2122（0．01～10μmol／L）可浓度依赖性地升高三叉神经节神经元细胞内[Ca^2＋]i，EC50为0．47μmol／L；用大麻素Ⅰ型受体（CBI受体）阻断剂AM251孵育后，发现10μmol／L的AM251可明显抑制10μmol／L WIN55。212—2对三叉神经节神经元细胞内[Ca^2＋]i的作用（P〈0．01）。结论WIN55，212—2可浓度依赖性地升高三叉神经节神经元细胞内[Ca^2＋]i，该作用可能是由CBI受体所介导。     

2,3,7,8-TCDD对培养乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度影响的研究

目的 测定培养SD大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度[Ca^2＋]i,观察2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,以下略为TCDD）对心肌细胞[Ca^2＋]i的影响。方法将实验动物分为0．05、0．5、5、10μg／kg4个染毒组,采用Fluo-3／AM同时加入Pluronic F-127作为细胞内游离钙离子的荧光探针,负载培养的心肌细胞,应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）技术检测空白组及染毒组乳鼠心肌细胞[Ca^2＋]i。结果静息时,心肌细胞[Ca^2＋]i为（77．68-4-12．00）nmol／L。染毒组心肌细胞的[Ca^2＋]i显示不同程度的升高,且呈剂量依赖性。结论应用Fluo-3／AM和Pluronic F-127结合CLSM技术可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,TCDD可能通过某种机制增加心肌细胞[Ca^2＋]i从而对乳鼠心脏功能产生一定损伤。     

吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究

目的 研究吗啡对海马神经元游离子浓度([Ca^2 ]i)影响的机制，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径。方法 运用新型荧光探针Fluo-4 , 利用激光共聚焦显微镜研究吗啡对大鼠培养海马神经元[Ca^2 ]i作用机制。结果 10μmol/L吗啡急性刺激引起海马神经元[Ca^2 ]i升高，μ阿片受体选择性拮抗剂CTOP（1μmol/L）不能阻断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，δ2阿片受体选择性拮抗剂Naltrindole(1μmol/L）阻断了吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i反应，特异性的内质网钙泵抑制剂Thapsigargin(TG,1μmol/L）预处理海马神经元组断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，L－钙通道阻断剂Verapamil(20μmol/L）预处理海马神经元不能完全抑制吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加；100μmol/L吗啡长时程（24h）作用于海马神经元，细胞内[Ca^2 ]i升高，加入10μmol/L纳络酮急性戒断后，不能阻断细胞内[Ca^2 ]i升高，反而引起[Ca^2 ]i异常升高。结论 吗啡急性刺激引起的海马神经元内钙增加主要来源于δ2阿片受体介导的IP3敏感的钙库释放。     

α-黑素细胞刺激素对体外培养黑素细胞迁移和细胞内钙离子浓度的影响

目的：探讨α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对体外培养黑素细胞迁移和细胞内钙离子浓度([Ca^2 ]i)的影响。方法：从正常人包皮分离并纯培养黑素细胞，用α-MSH处理纯培养的人表皮黑素细胞，用Transwell微孔膜法研究黑素细胞迁移，激光共聚焦扫描显微镜检测[Ca^2 ]i。结果：α-MSH可诱导黑素细胞迁移，并使[Ca^2 ]i浓度升高。结论：α-MSH可能通过诱导黑素细胞内的Ca^2 浓度升高，从而促进黑素细胞的迁移。     

17β-雌二醇诱导人精子顶体反应及胞内钙离子增加的研究

目的探讨雌激素对人精子的激活作用及其可能的作用机制。方法以17β-雌二醇(E2)及非透膜性大分子雌二醇-牛血清白蛋白交联物(E2-BSA)分别作用于生育力正常男性的精子,以三色法染色评价精子顶体反应(AR)发生率,流式细胞术检测精子内游离Ca2 浓度[Ca2 ]i的变化。结果E2可引起获能精子AR率明显增加,使[Ca2 ]i快速升高,对非获能精子则无明显影响;E2-BSA同样可以提高获能精子AR率及[Ca2 ]i,其作用与E2相似;E2诱导获能精子[Ca2 ]i升高依赖于胞外Ca2 的内流。结论雌激素对人精子有一定的激活作用,该作用可能是通过与人精子膜上的雌激素结合位点作用后使胞外Ca2 内流而实现的。     

PDGF-BB对肾小球系膜细胞[Ca2+]i和细胞增殖的影响

目的 研究肾小球系膜细胞[Ca^2 ]i的变化与系膜细胞增殖之间的关系。方法 以体外培养的系膜细胞为研究对象，激光共聚焦显微术结合Fura-3染色法，动态测定细胞[Ca2 ]i，MTT法测定细胞增殖。结果 血小板衍生生长因子(PDGF)-BB可浓度依赖性地引起肾小球系膜细胞[Ca^2 ]i的升高，并促进细胞增殖。钙通道阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂均可同时抑制PDGF-BB引起的细胞钙浓度升高和细胞增殖。中药成分雷公藤多甙在显著抑制系膜细胞增殖的同时，对细胞游离钙却无影响。结论 肾小球系膜细胞[Ca2 ]i的升高和细胞增殖之间存在着正性关联，但[Ca2 ]i的升高并非细胞增殖的唯一途径。     

西红花酸对过氧化氢诱发心肌细胞[Ca2+]i改变的作用

目的 观察西红花酸对H2O2诱发培养心肌细胞[Ca^2 ]i改变的效应，并探讨其机制。方法 应用Fluo-3／AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测不同因素处理的单个培养心肌细胞[Ca^2 ]i。结果 H2O2呈浓度依赖性地使单个培养心肌细胞[Ca^2 ]i增加，并不受细胞外环境是否存在Ca^2 的影响，L-型Ca^2 通道阻滞剂维拉帕米也不能完全中止[Ca^2 ]i的增加；不同剂量的西红花酸则能减低H2O2引发的单个培养心肌细胞[Ca^2 ]i增高的幅度。结论 西红花酸能明显抑制H2O2诱发培养心肌细胞[Ca^2 ]i增加的作用，可能与调整胞内钙库Ca^2 的释放和摄取、Ca^2 内流等机制有关。     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。     

14-3-3β蛋白特性及与卡波肉瘤的关系

酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白)是高度保守的可溶性酸性蛋白家族,它们在细胞有丝分裂、生长、分化、增殖和凋亡等过程中起重要的调控作用。其中14-3-3β蛋白在卡波肉瘤组织中高表达,与其发生、发展相关。本文就14-3-3β蛋白的特性以及与卡波肉瘤的关系予以综述。     

肺癌患者14-3-3σ基因启动子甲基化与其mRNA表达水平的关系

目的:探讨肺癌患者14-3-3σ基因启动子CpG岛甲基化状况与其mRNA表达水平的关系。方法:用实时定量PCR检测14-3-3σ基因mRNA在肺癌组织、正常肺组织及肺癌细胞株A549中的表达;用甲基化特异性PCR检测这些组织、细胞中14-3-3σ启动子区CpG岛甲基化状态。结果:14-3-3σ基因启动子在肺癌组织和正常肺组织中发生甲基化的频率分别为51.11%(23/45)和17.39%(4/23)(2χ=7.229,P=0.007)。14-3-3σmRNA在正常组织中全部表达,在肺癌组织中表达缺失率为15.56%(7/45),且表达量低于正常肺组织(t=10.309,P<0.001),不同肿瘤病理分型(SCLC、NSCLC)之间14-3-3σmRNA有显著差异(t=5.256,P<0.023),不同年龄、性别、肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)。14-3-3σ启动子甲基化与其表达量下降密切相关(r=0.48,P=0.04).结论:在肺癌中14-3-3σ启动子甲基化与其mRNA表达下调或缺失有密切关系,在肺癌发生中14-3-3σ异常甲基化起一定作用。     

神经元细胞信号传导蛋白质14-3-3ζ编码基因的扩增和克隆

目的 克隆神经元信号传导蛋白质14－3－3ζ编码基因，以研究其在人神经退行性病变中的诊断价值、细胞信号传导过程中的作用及对细胞分裂、细胞凋亡的影响。方法 提取人脑胶质瘤细胞总mRNA，以其为模板逆转录合成cDNA第一链，设计合成引物，用PCR扩增14－3－3ζ基因编码序列，将其插入pGEM-T载体，并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果 RT－PCR扩增出一条约750bp大小的特异性条带，重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR获得了一条与RT－PCR大小相同的条带。经DNA测序证明所克隆的DNA片段与GenBank收录序列一致。结论 信号传导蛋白质14－3－3ζ重组pGEM-T克隆载体的成功构建，为进一步研究提供了条件。     

Hsp70-2及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的检测Heat shock protein 70-2(Hsp70-2)及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)组织中的表达,探讨两者在肿瘤发展中的作用及临床意义。方法收集人膀胱尿路上皮癌标本48例,膀胱尿路上皮癌旁组织标本20例,利用免疫组织化学S-P法、Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hsp70-2、14-3-3zeta在蛋白水平和mRNA水平的表达,分析两者与膀胱尿路上皮癌的病理分级、临床分期等因素间的关系。结果 3种检测方法均显示Hsp70-2、14-3-3zeta在癌旁组织中低表达,在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,其表达量随病理分级程度及浸润深度增高而增高,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Hsp70-2与14-3-3zeta蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达均增高,两者呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 Hsp70-2与14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,与病理分级,临床分期呈正相关,且两者之间也呈正相关,提示两者在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。     

TRPV1和ASIC3基因敲除小鼠的寿命观察

目的：观察酸敏感离子通道亚基3（ASIC3,又名ACCN3）基因敲除ASIC3-/-小鼠、香草酸瞬时受体亚型I（TRPV1）基因敲除TRPV1-/-小鼠的生存曲线,为进一步繁殖使用该品系小鼠提供参考。方法选用105只基因敲除小鼠,其中ASIC3-/-鼠44只,TRPV1-/-鼠61只。观察正常喂养两种小鼠500d以内的生存情况,并绘制生存曲线,进行生存分析。结果ASIC3-/-小鼠与TRPV1-/-小鼠随着时间的延长,生存概率降低,经比较TRPV1-/-小鼠的生存概率优于ASIC3-/-小鼠的生存概率,两种小鼠的生存时间存在统计学差异,（P＝0.004,P＜0.01）,两种小鼠中不同性别之间的生存曲线无显著学差异。结论TRPV1-/-小鼠的生存概率优于ASIC3-/-小鼠的生存概率。而两种鼠不同性别之间的生存概率则基本相当。     

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析

目的：纯化日本血吸虫信号蛋白质14-3-3编码基因的原核表达产物。分析纯化产物的免疫学特性。方法：SDS-PAGE鉴定重组日本血吸虫14-3-3（rSj14-3-3)蛋白包涵体，超声破碎细胞收集包涵体。尿素溶解包涵体，NiSO4平衡层析柱，亲和层析纯化rSj14-3-3,Western-blot鉴定纯化产物的免疫学特性。结果：rSj14-3-3是以包涵体形式在大肠埃希菌中表达。通过亲和层析在32.5kDa附近得到单一蛋白条带，Western-blot证实纯化产物为rSj14-3-3，且具有与天然Sj14-3-3相同的抗原表位。结论：成功纯化了rSj14-3-3蛋白，为研究14-3-3在血吸虫信号转导中的作用奠定了基础。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇的合成工艺研究

目的 对(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇合成工艺进行研究。方法 以3-戊酮为起始原料,经Mannich反应、手性拆分、Grignard反应等步骤合成(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇,并对化学拆分进行工艺优化。结果 合成(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇,总收率为30.6%。结论 工艺改进后提高了目标产物的收率,同时也减少了原料的浪费。     

3-甲基-1-苯砜基-2-丁烯的合成

目的　探索具有抗癌活性的萜类化合物的合成方法 ,为大环二萜化合物的合成做准备。方法　以异戊二稀为原料与溴化氢 (HBr)发生 1,4—加成 ,然后与苯磺酸钠发生取代反应。结果　经过二步反应 ,合成为一种重要的中间体 3-甲基 - 1-苯砜基 - 2 -丁稀。结论　此合成路线原料易得 ,方法简便 ,为天然萜类化合物的合成奠定了基础