丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞增殖和细胞周期的影响

摘 要：目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞增殖和细胞周期的影响,探讨HCV-NS4B在HCV致病中的可能机制。方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2及重组质粒PCXN2-NS4B转染入 LO2肝细胞,G 418筛选。RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内。MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA、cyclinD1的表达情况。结果 NS4B转染入LO2有表达;绘制生长曲线示NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测显示转染空载体PCXN2的细胞57.73％±19.73％进入G0/G1期、29.25％±6.95％进入S期、6.80％±4.67％进入G2/M期;转染PCXN2-NS4B的细胞46.89％±5.60％进入G0/G1期、36.31％±4.36％进入S期、16.80％±6.79％进入G2/M期;转染NS4B的细胞PCNA、cyclinD1表达率较转染空白载体组高,两组比较差异有显著性（P<0.01）。结论 HCV-NS4B可能通过调节某些基因转录与表达,促进DNA合成,干扰肝细胞周期,促进肝细胞增殖。     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体,并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板,通过PCR反应扩增4 目的基因片段,采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连,转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞,通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达,免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒,经测序其与NCBI 公布的序列完全一致,并可在U2OS 细胞中表达,DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%,对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体,并可在U2OS 细胞中表达,诱导细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。     

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。     

筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒LO2稳定株差异表达基因和基因通路

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60％.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细?     

筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒L02稳定株差异表达基因和基因通路

目的：筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢
病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用
及机制提供依据。方法：将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2- mkate2复苏
扩增;应用Human Gene 1.0ST 芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因。基于京都基因和基因组百科全书(kyoto
encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行
显著性分析。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶C 结合蛋白(protein kinase C delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤
蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列 (baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平。结果：以LO2-NS4B与LO2-mkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上
调和1 236个基因表达下调。上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用
通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通
路、Wnt信号通路和细胞周期通路等。Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一
致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60%。结论：HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和
细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路。     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的 研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响.方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1) mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性.结果 基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1     

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素(IFN-α)和利巴韦林(RBV)联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2 和 NS3 蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B RdRp)为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5B RdRp抑制剂的研究进展。     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞周期及PCNA表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞周期及PCNA表达的影响,探讨HCV-NS4B在肝细胞增殖机制中的可能作用.方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2组及重组质粒PCXN2-NS4B转染入LO2肝细胞,G418筛选.RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内.MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA的表达情况.结果 NS4B转染入LO2有表达,生长曲线示HCV-NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测示转染PCXN2-NS4B组S期、G2/M期较PCXN2组增加,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);转染PCXN2-NS4B组PCNA表达率较PCXN2组高,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HCV-NS4B可能通过调节PCNA的表达,促进DNA合成,促进肝细胞增殖.     

丙型肝炎病毒NS3蛋白生物学功能研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)是一种严重威胁人类生命健康的微生物,持续感染可导致慢性丙型肝炎,并可发展为肝硬化和肝细胞癌。HCV非结构蛋白NS3在HCV复制和宿主细胞负面调控中发挥重要作用。因其具有的生物学功能,已成为HCV研究热点。本文就NS3主要生物学功能研究进展综     

HBV与HCV重叠感染的研究

应用ＰＣＲ法和套式ＰＣＲ法对深圳地区４４例ＨＢＶ血清学标志物阳性者进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测，并同时作ＨＢＶ－ＤＮＡ检测，以了解ＨＢＶ与ＨＣＶ重叠的感染情况，同时观察其血清ＡＬＴ的情况。结果发现，４４例患者中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性１２例（２７．２７％）；ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性２２例（５０．００％），抗ＨＣＶ阳性２１例（４７．７３％）．表明ＨＢＶ与ＨＣＶ的重叠感染率较高，应引起人们的重视。     

丙型肝炎患者肝组织中病毒抗原检测

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）抗原在患者肝组织中的分布状况及其相互关系。方法采取免疫组织化学方法，用多克隆抗－ＨＣＶ和单克隆抗－ＨＣＶ－ＮＳ３、抗－ＨＣＶ－ＮＳ５，对１０７例ＨＣＶ感染患者肝组织中ＨＣＶ抗原进行检测。结果应用三种抗体均从ＨＣＶ患者肝组织中检出相应抗原，检出率分别为３８．３％，２８．０％和５２．３％；阳性颗粒定位于肝细胞浆；阳性细胞分布呈散在、弥漫状和簇状；ＨＣＶ－ＮＳ３的表达与炎症反应无明显解剖学关系，ＨＣＶ－ＮＳ５阳性细胞较常见位于炎症灶旁或灶中。结论ＨＣＶ各成分在肝组织中的表达水平存在差别；ＨＣＶ－ＮＳ５的表达可能与ＨＣＶ的致病机制有关。     

乙型肝炎病毒基因分型研究进展

近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展和对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的深入研究发现,HBV基因型与乙型肝炎的临床表现、治疗、预后都有密切关系。本文着重对HBV基因型的发现和流行病学分布,HBV基因型的分型方法,HBV基因型与血清亚型的关系,HBV基因型的临床意义等相关研究作一综述。     

内毒素体外诱导人肝细胞凋亡的研究

目的 :探讨内毒素 (LPS)在体外直接作用于LO2细胞 ,引起细胞凋亡所表现出的病理及生物化学特性的变化。方法 :LPS诱导LO2细胞的凋亡。将LO2细胞培养 2 4h后换用含LPS( 2 0 μg/ml)的新鲜培养液 ,设多个时间点 ,提取肝细胞的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳观察肝细胞生物化学性质的改变 ;用透射电镜观察其形态学变化 ;TUNEL标记法观察细胞凋亡。结果 :LPS直接作用的LO2细胞在形态学上表现出胞浆浓缩核凝聚成团块、形成凋亡小体、细胞器机构基本正常等凋亡细胞的特征 ;在生物化学方面表现典型的凋亡梯形。肝细胞凋亡在处理后 2 4小时之内随处理时间的延长而增加。TUNEL检测结果显示染色阳性细胞。结论 :LPS在体外的直接作用可诱导正常肝细胞发生凋亡。     

血液透析患者丙型肝炎病毒感染的临床研究

为了探讨血透患者丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的感染情况及其影响因素，采用第二代ＥＬＩＳＡ法和ｎｓｅｔ－ＰＣＲ分别测定１４０例血透患者血清中ＨＣＶ和ＨＣＶ ＲＮＡ。结果：抗ＨＣＶ和ＨＣＶ ＲＮＡ的阳性率在血透组和非血透组之间差异非常显著，且随着血透时间延长而增高，５个以上患者达９４．６％；ＨＣＶ感染率与否输过血无关；采取严格隔离透析、透析器复用等预防措施可降低ＨＣＶ感染率。结论：血透明显增加丙型肝炎的感染，且与输血无关，预防措施有助于降低ＨＣＶ在血透患者中的发生率。     

某院住院患者乙型和丙型肝炎病毒感染状况调查与分析

目的了解医院住院患者乙型和丙型肝炎病毒感染的血清流行病学状况。方法采用酶联免疫法对医院2012年住院患者肝炎病毒血清标志物HBsAg和抗-HCV进行检测。结果住院患者HBsAg总体阳性率为9．84％,抗-HCV总体阳性率为0．75％;儿科HBsAg阳性率最低,为4．93％,血液内科抗-HCV阳性率最高,为1．94％,阳性率与其他科室差异有统计学意义（P〈0．05）;HBsAg和抗-HCV阳性率在性别差异无统计学意义（P〉0．05）;51～60岁年龄段HBsAg阳性率最高,0～10岁年龄段HBsAg最低,二组差异有统计学意义（P〈0．05）;从事服务业的住院患者HBsAg、抗-HCV阳性率最高,与其他职业阳性率差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论医院住院患者HBsAg阳性率较高,应做好患者院内感染和医务人员职业感染的预防工作,对感染患者予以及时有效的治疗。     

INFLUENCE OF HEPATITIS B AND HEPATITIS C VIRUS INFECTION ON THE OUTCOME OF KIDNEY TRANSPLANTATION

GREAT improvement inkidneytransplantatioovnerthepasttwo decadesisdue tobetterorganprese-rvatio,nimmunosuppression,and patientselectio.1nA major problem influencinrgenalallografotutcome ispre-sence of chronicliverdisease. In thesecases, hepatitiBsvirus(HBV ) and hepatitiCs virus(HCV ) infectionasrethemain causesofhepaticinjur.yReplicatioonfHBV isenhancedunderimmunosuppressionafterrenaltransplantati,oannd li-verinjuryprogressionseems to be greaterforpatientswithchronicHBV infectionthan th…     

乙型肝炎病毒相关性肾炎的临床病理研究

对 ４４ 例 Ｈ Ｂ Ｖ 抗原血症并有尿检异常的患者进行了临床及肝、肾经皮活检病理研究,用 Ｐ Ｃ Ｒ 法检测肾组织中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,根据结果分组进行治疗观察。结果表明, Ｈ Ｂ Ｖ 相关性肾炎发病率为６５９％ （２９／４４）。２９ 例中膜性肾病 １３ 例,膜增殖性肾炎６ 例,系膜增殖性肾炎１０ 例。肾组织中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 检出率为７２４％ 。慢性活动性肝炎并 Ｈ Ｂ Ｖ 相关性肾炎发病率高,用激素及干扰素配合治疗效果好。提示 Ｈ Ｂ Ｖ可通过多种机制引起肾损害, Ｈ Ｂ Ｖ 抗原血症并尿检异常并非全是 Ｈ Ｂ Ｖ 相关性肾炎。     

乙型肝炎病毒2型的研究

１９８７年Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ等首次报道发现有ＨＢＶ感染者血清中测不到抗－ＨＢｃ，并将其血清中的这种病毒命名为乙型肝炎病毒２（ＨＢＶ－２）型，随后，各国均有报道。我们对２．７万例ＨＢｓＡｇ阳性的原始检测记录进行回顾性调查，具有上述血清学特征者占４％，并对收集到的２５例血清样品进行了严格鉴定，结果显示其中绝大多数（８０％，２０／２５）仍为ＨＢＶ感染，２０％（５／２５）各项乙型肝炎指标全阴性，其中有７例为抗－ＨＢｃ阴性，但它们的核心基因，经Ｈ８Ｖ－ＤＮＡ－ＰＣＲ扩增仍为阳性。本研究未发现有与ＨＢＶ不同的毒株。     

乙型肝炎病毒和巨细胞病毒关系的研究

用血清学方法对血清中乙型肝炎病毒(HBV)标记物和人巨细胞病毒(HCMV)特异性抗体间的关系进行了研究探讨。HBsAg阳性的236份血清中,HCMV-IgM的阳性率显著高于对照组。对各种HBV标记物分别和HCMV特异性抗体的关系进行了分析,血清中HBeAg与HCMV-IgM间密切相关。如果排除HBeAg的影响,HBsAg同HCMV-IgM的关系无统计学意义。研究结果表明,HBV同HCMV活动性感染间存有一定关系,二者可以相互诱发或促进,引起双重感染。