丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞增殖和细胞周期的影响

摘 要：目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞增殖和细胞周期的影响,探讨HCV-NS4B在HCV致病中的可能机制。方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2及重组质粒PCXN2-NS4B转染入 LO2肝细胞,G 418筛选。RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内。MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA、cyclinD1的表达情况。结果 NS4B转染入LO2有表达;绘制生长曲线示NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测显示转染空载体PCXN2的细胞57.73％±19.73％进入G0/G1期、29.25％±6.95％进入S期、6.80％±4.67％进入G2/M期;转染PCXN2-NS4B的细胞46.89％±5.60％进入G0/G1期、36.31％±4.36％进入S期、16.80％±6.79％进入G2/M期;转染NS4B的细胞PCNA、cyclinD1表达率较转染空白载体组高,两组比较差异有显著性（P<0.01）。结论 HCV-NS4B可能通过调节某些基因转录与表达,促进DNA合成,干扰肝细胞周期,促进肝细胞增殖。     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞周期及PCNA表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞周期及PCNA表达的影响,探讨HCV-NS4B在肝细胞增殖机制中的可能作用.方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2组及重组质粒PCXN2-NS4B转染入LO2肝细胞,G418筛选.RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内.MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA的表达情况.结果 NS4B转染入LO2有表达,生长曲线示HCV-NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测示转染PCXN2-NS4B组S期、G2/M期较PCXN2组增加,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);转染PCXN2-NS4B组PCNA表达率较PCXN2组高,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HCV-NS4B可能通过调节PCNA的表达,促进DNA合成,促进肝细胞增殖.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p53表达的影响，研究其在肝癌发生中的作用及其发生机制。方法：设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组，使用脂质体介导转染法，转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2～NS4B进入Chang肝纠胞内，并用G418筛选获得稳定表达细胞。RT-PCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内，采用免疫细胞化学法检测p53表达率。结果：空白对照组无p53表达，空白载体组呈弱阳性表达，转染NS4B组呈阳性表达，与空白对照组、空白载体组比较转染NS4B组有显著差异（P〈0．01）。结论：丙型肝炎病毒NS4B促进p53表达，可能在丙肝病毒的致痛机制中起到重要作用。     

转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的了解丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p5 3表达的影响 ,探讨其在肝癌发生中的作用 ,及其发生机制。方法使用脂质体介导法 ,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2 NS4B及突变型p5 3基因重组质粒P5 3 CX2 2AN3进入Chang肝细胞内 ,并用G4 18筛选获得稳定表达细胞 ,分别采用细胞化学法检测p5 3表达率。设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组 ,转染p5 3组、共转染NS4B及p5 3组。结果空白对照组无p5 3表达 ,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达 ,转染p5 3组及共转染组呈阳性表达 ,与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较有显著差异 ,P <0 .0 1。结论NS4B可能抑制突变型p5 3表达 ,也可能阻止其进入细胞核。     

Caspase-3与Survivin在肝细胞肝癌中的表达

目的探讨Caspase-3及Survivin在原发性肝细胞癌（HCC）中的表达。方法采用免疫组织化学SP法分别检测48例HCC、40例癌旁组织、25例肝硬化及8例正常肝组织中Caspase-3和Survivin的表达。结果①Survivin在肝硬化、癌旁肝组织及HCC组织中阳性率分别为8％、5％及43．8％（P〈0．01）,Survivin在高、中、低分化HCC组织中的表达阳性率差异无显著性（P〉0．05）。②Caspase-3在正常肝组织、肝硬化、癌旁肝组织及HCC组织中阳性率分别为87．5％、84％、85％及60．4％,Caspase-3在正常肝脏与HCC组织中表达的差异具有显著性（P〈0．05）,Caspase-3在高、中、低分化HCC组织中的表达阳性率差异无显著性（P〉0．05）。③Caspase-2和Survivin在HCC组织中表达呈明显的负相关性（r=-0．39,P〈0．01）。④Survivin和Caspase-3的阳性表达率与HCC患者的临床病理特征无关（P〉0．05）;但Survivin的阳性表达与HCC的大小相关。结论HCC中Survivin的高表达及Caspase-3的失表达可能与HCC的生长有关,在HCC中Caspase-2和Survivin表达的负相关性可能与HCC的发生发展有密切关系,与预后的关系有待进一步研究。     

无精子症患者病理组织中Survivin与Cnspase-3的相关性研究

目的探讨生存素（Survivin）与半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）在无精子症睾丸中的表达相关性。方法用免疫组织化学方法检测44例无精子症患者睾丸组织中的Survivin、Caspase-3。结果Survivin阳性（＋-＋＋＋）表达率在生精功能正常组与生精功能异常组分别为100．0％（11／11）、63．6％（21／33）,两者比较差异有统计学意义（P〈0．05）;Caspase．3阳性（＋-＋＋＋）表达率在生精功能正常组与生精功能异常组中分别为18．2％（2／11）、39．4％（13／33）,两者比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Survivin与Caspase-3表达呈负相关（r=-0．636,P〈0．05）。结论Survivin与Caspase-3的低表达可能共同参与了人睾丸精子生成过程。     

丙型肝炎患者抗—NS5抗体与α—干扰素疗效关系的研究

目的：探讨丙型肝炎患者IgG抗－NS5抗体与α-干扰素疗效的关系。方法：以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以ELISA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗－NS3、抗－NS5、抗－HCV抗体及其滴度。结果：α－干扰素治疗有效组的抗－NS5抗体的阳性率为80％（8／10）,无效组为20％（2／10）,两组比较有显著差异（P＜0．05）;有效组抗－NS5抗体滴度显著性高于无效组（P＜0．05）;有效组和无效组抗－NS3、抗－HCV本阳性率及抗体的滴度无明显差异（P＞0．05）。结论：治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标。     

汉黄芩素对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、Survivin及Caspase-3表达的影响

目的探讨汉黄芩素在人胶质瘤患者中对U251细胞的增殖与凋亡及对存活素（Survivin）及半胱天冬酶-3（Caspase-3）表达的影响。方法不同浓度汉黄芩素作用于人胶质瘤96株U251细胞,并与使用替莫唑胺（TMZ）的阳性对照组（48株）及未给予任何药物的空白对照组（48株）对比细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及Survivin和Caspase-3蛋白的表达强度。结果各浓度汉黄芩素对细胞增殖抑制率均显著高于空白对照组,且随药物浓度及作用时间的增加呈现出显著增高趋势（P〈0．05）,汉黄芩素组细胞凋亡率显著高于TMZ组（P〈0．01）,TMZ组显著高于空白对照组（P〈0．01）,在汉黄芩素组内,细胞凋亡率随着药物浓度增加显著增加（P〈0．05）;汉黄芩素组Survivin表达强度佩著低于TMZ及空白对照组（P〈0．01）;两药物组Caspase-3表达强度显著高于空白对照组（P〈0．01）。结论汉黄芩素可通过调节Survivin、Caspase-3蛋白的表达对胶质瘤U251细胞起到诱导凋产的作用。     

肝细胞肝癌中COX-2表达与Survivin和Caspase-3的关系

目的研究肝细胞肝癌（HCC）中COX-2与Caspase-3、Survivin蛋白表达的关系及其意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测44例HCC组织COX-2、Caspase-3和Survivin的表达情况。结果HCC中COX-2、Caspase-3和Survivin蛋白表达阳性率分别为52．3％、75．0％、75．0％。COX-2和Survivin蛋白的表达呈显著正相关（r=0．394，P〈0．01），COX-2和Caspase-3蛋白的表达呈显著负相关（r=-0．447，P〈0．01）。结论HCC中COX-2的抗凋亡通路可能是通过上调Survivin、下调Caspase-3途径实现的。     

Survivin与Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表达及化疗对其的影响

目的：研究Survivin和Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表达和相互关系,以及化疗对其表达的影响。方法：运用免疫组织化学（S-P法）方法,检测Survivin和Caspase-3在99例卵巢组织中的表达。结果：Survivin在未化疗的上皮性卵巢癌中的表达率显著高于正常卵巢、良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤（P均〈0．05）;而Caspase-3则相反（P均〈0．05）;Survivin与病理分级和临床分期均有关（P均〈0．05）;Caspase-3与临床分期有关（P〈0．05）;Survivin和Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表达无相关性。结论：Survivin的表达与Caspase-3的缺表达可能参与了卵巢癌的发生发展过程,与卵巢癌的预后和耐药机制有关;Survivin有望成为卵巢癌早期诊断的筛查性标记物;针对Survivin和Caspase-3的靶向治疗有可能提高化疗效果和减少耐药。     

Potential effect of hepatitis C Virus non-structural protein 4B on liver carcinogenesis

INTRODUCTION The hepatitis C virus (HCV) is a leading causeof chronic liver disease and is estimated to in-fect over 100 million people in the world. HCV isclosely associated with the hepatocellular carcinoma(HCC) [1]. However, the carcinogenesis of HCV isnot well understood. Unlike hepatitis B virus, HCVis a RNA virus, which can integrate with the hostgenome. So abnormalities of tumor suppressor genesand oncogenes, inhibition of cell apoptosis may beinvolved with the development …     

EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响

目的：探讨肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对EpCAM和CD13表达的影响.方法：Western blot检测正常肝细胞系（LO2细胞）和肝癌细胞系（Huh7,Bel-7404,Hep3B,QSG-7701细胞）中肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13的表达情况,同时建立稳定转染HBx基因的Bel-7404 （Bel-7404/HBx）细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测转染后EpCAM和CD13表达情况.结果：EpCAM和CD13在不同的肝癌细胞系中表达水平完全不同;转染HBx基因后EpCAM的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的（2.04±0.16）和（2.03±0.25）倍;而CD13的mRNA和蛋白表达水平明显下调,分别为对照组的（69±8）％和（55±7）％.结论：肝癌干细胞可能存在多个干细胞亚群,在不同的肝癌细胞中干细胞标记物的表达水平不同,而HBX对不同亚群的影响也不同.     

鸦胆子油乳联合顺铂对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及其机制

目的研究鸦胆子油乳联合顺铂对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制与凋亡作用,探讨鸦胆子油乳联合顺铂的抗肿瘤作用及其机制。方法采用甲基噻唑基四唑法检测HeLa细胞生长抑制率;流式细胞仪检测各组药物对HeLa细胞凋亡的影响;免疫细胞化学法检测Survivin和Caspase-3蛋白表达水平。结果空白对照组、顺铂组、鸦胆子油乳组和鸦胆子油乳联合顺铂组HeLa细胞的凋亡率分别为(9.91±0.35)%、(13.65±0.18)%、(10.68±0.21)%、(15.56±0.37)%;顺铂组、鸦胆子油乳组、鸦胆子油乳联合顺铂组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);鸦胆子油乳联合顺铂组与顺铂组和鸦胆子油乳组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。空白对照组、鸦胆子油乳组、顺铂组和鸦胆子油乳联合顺铂组Survivin蛋白表达阳性细胞率分别为(84.22±2.96)%、(61.77±4.40)%、(29.47±3.74)%、(13.75±1.79)%,经两两比较差异均有统计学意义(P<0.01);Caspase-3蛋白表达阳性细胞率分别为(12.70±3.42)%、(38.32±2.76)%、(71.36±3.14)%、(91.31±2.23)%,经两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论鸦胆子油乳与顺铂联合对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制有协同作用;鸦胆子油乳联合顺铂诱导HeLa细胞凋亡可能与降低Survivin蛋白表达和增强Caspase-3蛋白表达有关。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

姜黄素对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及Caspase-3表达的影响

目的：观察姜黄素（Cur）对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化及对其肝组织转化生长因子-β1（TGF-β1）及半胱天冬酶-3（Caspase-3）表达的影响．方法：采用皮下注射400g／L四氯化碳复制模型,造模后给予姜黄素治疗,观察肝组织病理改变并进行肝纤维化分级和血清生化学检测;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1及Caspase-3蛋白表达的变化,RT-PCR检测肝组织中TGF-β1mRNA表达．结果：Cur治疗组大鼠肝纤维化程度较模型组显著减轻（P〈0．01）;并且大鼠血清ALT（nkat／L）,AST（nkat／L）,ALP（nkat／L）水平明显降低[（757±234）惦（1677±252）,（2776±238）VS（4865±403）,（1850±191）掷（4310±728）,P〈0．05或P〈0．01],A／G比值提高[（0．89±8．06）US（0．60±7．48）,P〈0．05];Cur治疗组TGF-β1mRNA,TGF-β1表达较模型组显著下降[（3．13±1．55）粥（9．56±2．01）,（0．32±0．12）傩（0．87±0．40）,P〈0．05或P〈0．01];Caspase-3表达较模型组显著升高[（5．47±1．06）US（1．56±0．61）,P〈0．05]．结论：Cur对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化具有显著的治疗作用,其作用机制可能与抑制TGF-β1表达、促进Caspase-3表达相关．     

Survivin与Caspase-3在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达及意义

目的：研究凋亡相关蛋白Survivin（生存素）和Caspase-3（半胱氨酸蛋白酶-3）在妊娠高血压疾病（HDCP）患者胎盘细胞中的表达情况,探讨其与HDCP发生发展的相关性,为进一步明确HDCP的发病机制提供研究依据。方法：随机选取60例HDCP患者（其中子痫前期轻度28例,子痫前期重度32例,分别为轻度组、重度组）胎盘组织和30例健康孕妇（对照组）胎盘组织,采用免疫组化S—P法检测胎盘组织中Sur-vivin和Caspase-3的表达,并用图像分析系统对染色结果进行分析。结果：①Survivin在重度组表达显著低于轻度组及对照组,差异有显著性（P〈0.01）;轻度组与对照组比较,无显著性差异（P〉0.05）;②Caspase-3表达在轻度组与重度组显著高于对照组,差异均有显著性（P〈0.01）;重度组高于轻度组,差异有显著性（P〈0.01）。③Survivin与Caspase-3在两组胎盘组织中表达呈负相关（R=-0.413,P〈0.01）。结论：在HDCP患者胎盘组织中Survivin表达下调、Caspase-3表达上调,HDCP的发病机制可能与Survivin及Cas-pase-3表达变化有关。