EMBL3DNA用于构建肝豆状核变性患者基因组文库

以EMBL 3 DNA为载体,构建肝豆状核变性(HLD)患者的基因组文库。从HLD患者白细胞提取高分子量DNA,经Sau 3A部分酶解,电泳回收15～23kb DNA片段,EMBL 3 DNA用BamHI及EcoRI进行双酶解,两者经T_4 DNA连接酶连接成重组DNA分子。从E.coli溶原菌BHB2688及BHB2690用冻融法及超声破碎法提取包装蛋白,包装效率为1～8x10~7pfu/μg EMBL 3 DNA。连接分子用包装蛋白体外包装,获得了9.2×10~6个重组子,达到建库要求。     

恒河猴高重复顺序DNA的分子克隆(摘要)

哺乳动物基因组中高重复顺序可用限制性内切酶消化DNA经用电泳分离获得,本文用限制性内切酶BamHI消化恒河猴DNA分离得到一系列高重复片段。用其中最小片段与质粒pBR322共价连接,转化到大肠杆菌后得到3个带有重组子的克隆.其中PMBI克隆用BamHI,Pstl酶解,杂交鉴定,证明此克隆是含有重组的恒河猴高重复片段,此片段大小约为340碱基对.     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。     

重组DNA技术及其在医学领域中的应用

重组DNA技术属于遗传工程分子水平的遗传操作,是一种按照人的意志定向改变生物遗传性状的技术。广义的遗传工程包括细胞水平的遗传操作(称为细胞工程)和分子水平的遗传操作(称为重组DNA技术)。狭义的遗传工程就是重组DNA技术。重组DNA技术,是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸),并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作,这种操作可将特定的基因组合到载体上,并使其在受体细胞中增殖和表达。因此,它不受亲缘关系限制,为分子遗传学和育种学以及医学遗传学研究开辟了崭新途径。1 重组DNA技术基本过程1.1 用人工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位,基因可被分离出来。例如,从大肠杆菌中可将乳精发酵基因分离出来。先利用两种有差异的亲缘关系相近的温和噬菌体分别感染两类大肠杆菌,噬菌体的DNA可与大肠杆菌的染色体发生整合。整合位置恰好都在含乳糖发酵基因DNA片段,但方向相反,整合到大肠杆菌中的噬菌体DNA得到复制,用紫外线刺激大肠杆菌,使带乳糖发酵基因的噬菌体,DNA可以从大肠杆菌染色体中脱出,形成带乳糖发酵基因的噬菌体。两种亲缘关系相近的温和噬菌体,通过加热使其DNA片段双链分开,形成单链DNA。进一步将两种噬菌体DNA单链混合在     

我国人乳头瘤病毒基因组无性繁殖系的建立

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)可引起下生殖道尖锐湿疣,与宫颈及下生殖道肿瘤的发生有关。我们收集经临床病理确诊的尖锐湿疣检材,提取纯化病毒DNA,用限制性核酸内切酶EcoRI水解,得到DNA酶解片断。用同一酶对载体pUC-19质粒DNA酶解,与病毒DNA片断重组后转化大肠杆菌JM-103株。筛选转化菌并提取重组质粒DNA,经     

人嗜铬粒蛋白A N-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达

目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。     

人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

目的构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法人工合成1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物，以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因。用A-T克隆法与pUCm-T载体连接后，再定向插入原核表达载体pBV220，将重组体pBV220．hBDNF转化大肠杆菌DH5a，经42℃热诱导表达。结果经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF，并成功表达出hBDNF蛋白。结论该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达，表达效率达25％，为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。     

人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化

目的探讨人内皮细胞特异性分子-1(hESM-1)表达载体的构建、体外表达及表达产物的初步纯化.方法从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,用反转录-PCR扩增出hESM-1的cDNA.插人质粒pET-28b中构建成表达载体,转化人大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,表达产物用电洗脱的方法初步纯化.结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为含hESM-1的重组质粒,经SDS-PAGE分析证实获得产物为分子量23 808 u的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的24%.结论成功构建了重组hESM-1表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为进一步研究及临床应用奠定了良好基础.     

人亲环素A基因克隆及在大肠杆菌中表达

目的 :用基因重组技术表达人亲环素 A( Cy PA) ,以避免从人组织材料中提取纯化该蛋白的麻烦。　 方法 :应用反转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术从人淋巴细胞系 ( MT4 )总 RNA中扩增得到 Cy PA基因片段 ,并用重组 DNA技术对该基因片段进行克隆 ,构建表达载体 ,转入大肠杆菌进行表达。　 结果 :DNA序列分析表明 ,得到的基因片段与设计编码 Cy PA的结构基因序列完全相同。所构建的表达载体 p ET11/Cy PA转入大肠杆菌获得表达 ,重组蛋白表达量占菌体可溶性蛋白的 4 1% ,经测定具有肽基脯氨酸顺 /反异构酶活性。　 结论 :利用基因重组技术使大肠杆菌高效表达出有生物活性的人 Cy PA。     

白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定

目的构建人IL-31原核表达载体，在大肠杆菌中表达，研究人IL-31对人表皮角化细胞分泌趋化因子MIP-3β的活性影响。方法大量培养pET28a（＋）-hIL-31工程菌株，提取质粒，BamHI、HindⅢ双酶切，并将其连接到原核表达载体pET32a（＋），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。用RT-PCR检测该目的蛋白对人表皮角化细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β的影响。结果原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，序列正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达，纯化后的目的蛋白可刺激人表皮角化细胞表达MIP-3β。结论原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，纯化后的蛋白具有生物学活性，可刺激人表皮角化细胞表达趋化因子MIP-3β，为研究人IL-31的作用及其作用机制和制备单克隆抗体奠定了基础。     

大肠埃希菌近三年耐药监测结果分析

目的:了解大肠埃希菌对常用抗生素的耐药性及耐药趋势,以指导临床合理用药.方法应用WHONET5对我院2004年1月～2006年7月临床分离的616株大肠埃希菌药敏结果进行统计分析.结果大肠埃希菌对氨苄西林、哌拉西林、奥格门叮、复方磺胺、环丙沙星耐药率大于60%,庆大霉素、头孢唑林、头孢呋新耐药率在50%左右,哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西丁、阿米卡星和呋喃妥因耐药率较低,均小于20%,亚胺培南无耐药菌株;大肠埃希菌ESBLs检出率2004～2006年分别为27.96%、32.68%、35.12%.结论:大肠埃希菌对青霉素类及青霉素类/克拉维酸、磺胺类、喹诺酮类、庆大霉素、第一代头孢、第二代头孢已高度耐药,临床不宜选用;青霉素类/他唑巴坦、第四代头孢、头霉素类、碳青霉烯类、阿米卡星、呋喃类耐药率较低,临床可选用;第三代头孢耐药率也较低,由于易诱导ESBLs应慎用;大肠埃希菌产ESBLs率呈逐年上升的趋势.     

大肠埃希菌耐药率及耐药趋势的探讨

目的 利用“ＷＨＯＮＥＴ４”软件监测大肠杆菌对几类常用抗生素在１９９５年～１９９８年４年间耐药性的变迁。方法 采用常规鉴定技术鉴定细菌,Ｋ－Ｂ法测定抑菌环直径,利用“ＷＨＯＮＥＴ４”软件对结果进行录入和分析。结果 大肠杆菌对丁胺卡那在１９９６年和１９９８年的耐药率有显著差异（Ｐ〈０．０５）,丁胺卡那其他年份的耐药率及其他六种抗生素各年份间的耐药率无显著性意义（Ｐ〉０．０５）。庆大霉素、先锋Ｖ、头孢     

内源性血管生成抑制因子Arresten原核表达载体的构建及表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并在E.coliDH5α进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coliDH5α进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因并构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

泌尿系大肠埃希氏菌细菌型伴L型的耐药性分析

用１０种抗生素对３９例致泌尿系混合感染的大肠埃希氏菌细菌型伴Ｌ型（Ｂ＋Ｌ）分别作了体外抗生素敏感试验，并按美国临床实验室标准委员会（ＮＣＣＬＳ）的标准分析标准菌株，质控符合ＮＣＣＬＳ。结果表明对丁胺卡那霉素的耐药率最低（＜５．１３％），对三种氟喹诺酮药物的耐药率较低（均为７．６９％），对某些青霉素类的耐药率最高（＞８７．１８％）。实验证实，可用Ｋ－Ｂ法做大肠埃希氏菌Ｌ型的抗生素敏感试验，并提示氨基甙类尤其是丁胺卡那霉素和氟喹诺酮类药物是治疗泌尿系混合感染的大肠埃希氏菌（Ｂ＋Ｌ）的有效药物     

人钙调素基因Ⅲ表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ），将其插入表达载体ｐＢＶ２００，构建重组表达质粒ｈＣａＭⅢ／ｐＢＶ２００，用酶切、ＤＮＡ测序、ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。用ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α使其表达ＣａＭ蛋白。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白，经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可观察到一分子量与理论值相符（约１７０００）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的２０％。进一步分析表达产物的性质表明，ＣａＭ主要以可溶性形式表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，１７０００的表达条带可与标准鼠抗ＣａＭＭｃＡｂ起特异反应。结论：重组人ＣａＭ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究ＣａＭ的生物学功能及研制抗ＣａＭ单克隆抗体奠定了基础     

大肠埃希菌超广谱-β内酰胺酶胺酶的检测及耐药性分析

目的了解我院大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率及耐药情况,为临床治疗提供依据.方法对我院2002年1月～2004年12月住院病人分离的大肠埃希菌311株,采用NCCL推荐的纸片扩散表型确证试验进行ESBLs检测,用K-B法做药敏试验.结果检出ESBLs菌78株,检出率33.48%.产ESBLs菌的耐药率显著高于不产ESBLs菌(P＜0.005).产ESBLs菌对亚胺培南的耐药率低.结论应对ESBLs菌进行检测和监测,以指导临床用药.亚胺培南可作为ESBLs菌治疗的首选药.     

健康学生大肠埃希菌第1类整合子的鉴定及特征

目的：探讨健康学生肠道大肠埃希菌携带第1类整合子的分布及所含基因盒的特征。方法：常规方法分离大肠埃希菌;纸片扩散法对10种抗生素进行耐药性监测和分析;PCR鉴定第1类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果：从97份标本中鉴定出大肠埃希菌76株,其中25株（32.8%）为多重耐药,耐药谱为复合磺胺-氨苄西林-四环素-红霉素-链霉素。25株中有14株(56.0%)鉴定出1类整合子,1 800 bp 10株, 750 bp 4株。PCR产物测序得知1 800 bp整合子携带aadA1-dfrA14-orf基因盒,传递对氨基糖苷类-磺胺类抗菌药物的耐药性;750 bp整合子携带dfrA14基因盒,传递对磺胺类抗菌药物的耐药性。结论: 不同种类的1类整合子存在于健康人大肠埃希菌中,携带耐药基因盒,决定多重耐药性。      

大肠埃希菌超广谱-β内酰胺酶的检测及耐药性分析

目的:了解我院大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率及耐药情况,为临床治疗提供依据。方法:对我院2002年1月~2004年12月住院病人分离的大肠埃希菌311株,采用NCCL推荐的纸片扩散表型确证试验进行ESBLs检测,用K-B法做药敏试验。结果:检出ESBLs菌78株,检出率33.48%。产ESBLs菌的耐药率显著高于不产ESBLs菌(P<0.005)。产ESBLs菌对亚胺培南的耐药率低。结论:应对ESBLs菌进行检测和监测,以指导临床用药。亚胺培南可作为ESBLs菌治疗的首选药。     

150株大肠埃希菌临床分离株的分布及耐药性分析

目的：对本院150株大肠埃希菌临床分离株的分布及耐药性进行分析,指导临床合理使用抗生素。方法：按卫生部《临床检验操作规程》进行菌株分离,采用德灵公司Microscan常规革兰氏阴性复合板进行菌株鉴定及药敏试验,对近2年来我院大肠埃希菌的耐药性进行回顾调查分析。结果：临床标本中共分离得到大肠埃希菌150株,其中痰标本的检出率最高占54．5%,科室分布ICU最高占20．0％,其中：氨苄西林／舒巴坦钠、氨苄西林、头孢唑啉、哌拉西林、复方新诺明耐药率〉80％,亚胺培南为1．5％,耐药率最低。