人膜型LIGHT分子对Mo-DC成熟和T细胞激活的调节作用

利用我们建立的表达人膜型LIGHT分子的基因转染细胞(L929/LIGHT)探讨LIGHT/HVEM信号体外对Mo-DC诱导分化的影响,并进一步研究其对T细胞活化和抗凋亡的共刺激作用。从健康人外周血中分离的单核细胞经GM-CSF联合IL-4诱导形成Mo-DC,流式细胞术分析Mo-DC诱导过程中HVEM和LIGHT的表达;基因转染细胞L929/mock、L929/LIGHT、L929/CD40L或L929/LIGHT联合L929/CD40L,分别经丝裂霉素处理后,与GM-CSF联合IL-4诱导的Mo-DC共育,流式细胞术检测Mo-DC细胞表面成熟标志CD83和CD86的表达,利用FITC-Dextran分析Mo-DC对抗原的摄取能力;L929/LIGHT或L929/mock经丝裂霉素处理后,与抗人CD3单抗激发的T细胞共育,流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞表面活化标志CD25的表达,Annexin V和PI双标记分析T细胞的凋亡率。结果表明,高表达HVEM的单核细胞在诱导形成成熟Mo-D(iDC)的过程中下调了HVEM的表达,成熟Mo-DC(mDC)又上调表达HVEM,而LIGHT在Mo-DC分化过程中呈短暂的诱导性表达;基因转染细胞L929/LIGHT及其联合L929/CD40L能上调Mo-DC表面共刺激分子CD83和CD86的表达,并下调Mo-DC对FITC-Dextran的摄取能力;L929/LIGHT细胞能上调CD4+、CD8+T细胞CD25的表达,并增强T细胞抗凋亡能力。因此,基因转染细胞L929/LIGHT表面表达的人膜型LIGHT分子介导的LIGHT/HVEM共刺激信号对Mo-DC的诱导成熟和T细胞活化及抗凋亡能力具有促进作用。     

人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究

为建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白,采用PCR法从本单位构建的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区,Xho I、BamH I双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP-Fc,同时PCR法从pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段,用Nhe I、Xho I双酶切插入上述pIRES2-EGFP-Fc构建重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以该重组载体转染鼠CHO细胞,G418筛选并亚克隆化。Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化,Western blot作定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与L929/HVEM细胞有效结合,纯化的融合蛋白经Western blot鉴定有清晰的目的条带,而且BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。     

人共信号分子HVEM在外周血PBMC表达特性及其对T细胞的生物学作用

HVEM既可作为受体与LIGHT作用传递正性共刺激信号,又能作为配体作用于BTLA介导负性共抑制信号。为深入探讨HVEM对T细胞复杂而又独特的调控作用,本文研究了HVEM在免疫细胞上的表达特性,初步探讨了T细胞表达的HVEM分子所介导的生物学作用。采用LPS刺激人新鲜PBMC,以及PHA或PMA/IM刺激活化T细胞;间接免疫荧光标记和流式细胞术检测HVEM表达;MTT法分析T细胞增殖作用。结果显示,HVEM在不同条件刺激活化的T细胞表面均呈现先上调后下调表达;T细胞增殖试验表明,基因转染细胞L929/LIGHT能够明显促进T细胞的增殖及IL-2和IFN-γ的分泌,而以抗人BTLA单抗在一定程度上模拟HVEM所介导的BTLA/HVEM信号能够明显抑制T细胞增殖作用及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10的产生。     

人VSIG4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究

目的:分别构建含有人VSIG4基因两种不同变异体(VSIG4L和VSIG4S)的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达VSIG4L和VSIG4S基因的L929细胞并初步研究其对T细胞的共刺激作用及可能机制.方法:从人肺cDNA文库中扩增出VSIG4L和VSIG4S的全长基因,并分别克隆入T载体中,再双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-Term中,与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,以其培养上清感染L929细胞72小时后,经Zeocin筛选出稳定表达VSIG4L或VSIG4S分子的L929细胞株;采用RT-PCR和流式细胞仪分析VSIG4分子的表达,MTT和ELISA分别检测T细胞增殖及IL-2的分泌.结果:构建了含人VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组逆转录病毒载体,并获得含有VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组病毒,筛选获得能稳定高表达人VSIG4L和VSIG4S分子的L929转基因细胞;该转基因细胞具有体外抑制T细胞增殖、活化和IL-2分泌的作用.结论:构建了稳定表达人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的细胞株,该分子两种不同变异体在体外均可抑制T细胞增殖和IL-2分泌.     

人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响

利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞,mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白。利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌。     

B7-H3Ig重组蛋白的真核表达及其对T细胞的作用

目的 真核表达人B7-H3Ig重组蛋白,探讨B7-H3信号在T细胞中的作用.方法 重叠PCR方法构建B7-H3Ig重组基因,进而获得重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/B7-H3Ig,转染L929细胞建立L929/B7-H3Ig基因转染细胞株,纯化获得B7-H3Ig重组蛋白.体外激发型CD3单克隆抗体(mAb)刺激活化T细胞过程中加入B7-H3Ig,观察其对T细胞增殖以及IL-10与IFN-γ分泌的作用.结果 B7-H3Ig经Protein G柱纯化后纯度＞90％,浓度达0.559 mg/mL.重组蛋白结合实验表明CD3 mAb刺激48 h后T细胞表面B7-H3受体表达达到高峰.B7-H3Ig以剂量依赖方式促进CD3 mAb诱导的T细胞体外增殖与IL-10和IFN-γ分泌.结论 成功建立真核表达人B7-H3Ig基因转染细胞株,B7-H3Ig协同刺激T细胞增殖与IL-10和IFN-γ分泌.     

人B7-H4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究

目的 构建含有人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体，获得稳定表达B7-H4基因的1929细胞并初步研究其对T细胞的共信号作用及可能机制。方法从含人B7-H4基因的cDNA序列FLJ22418中，采用PCR扩增出B7-H4全长基因，双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-HA-Term，与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T，用其培养上清感染1929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达B7-H4蛋白的L929细胞株；采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析免疫分子的表达、^3H-TdR掺入检测细胞增殖以及ELISA测定细胞因子的水平。结果构建了含人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体和获得含有B7-H4基因的重组病毒，筛选获得能稳定高表达人B7-H4蛋白的I_929转基因细胞；该转基因细胞对T细胞体外具有抑制增殖、活化和细胞因子分泌的作用。结论构建了稳定表达人B7-H4蛋白的细胞株，B7-H4分子在体外通过抑制T细胞分泌IL-2和促进其凋亡作用可显著地下调T细胞功能的效应。     

转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-Term中构建成重组载体pEGZ-Term/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFN-γ和IL-10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。     

一株鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制特异性鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。以高表达人PD-1分子的基因转染细胞L929/PD-1作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-1作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Western blot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和MTT增殖实验对单抗进行生物学特性的分析。结果表明,成功获得1株特异、稳定分泌鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6E2。对6E2生物学功能的研究结果提示,该单抗能够识别活化T细胞表达的PD-1分子,且在体外能够显著抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌。获得的特异性鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体,通过激发PD-1负性途径能够有效抑制T细胞的功能,为进一步研究PD-1信号奠定了物质基础。     

鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。     

小鼠B7-H3对T细胞的体外正性协同刺激作用

小鼠B7-H3作为协同刺激分子的生物学功能至今尚未明确.本文拟通过构建小鼠B7-H3基因的真核表达载体,获取稳定表达小鼠B7-H3基因的细胞株,并进一步通过体外实验研究其对T淋巴细胞体外活化及功能的调节作用.作者运用RT-PCR技术从小鼠肝脏组织中获得全长小鼠B7-H3基因,并构建真核表达载体pIRES2-B7-H3,...     

人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B.方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达.MTT分析基因转染细胞株 L929-huCXCR3B 在Mig( monokine induced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力.结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93％.该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44％、44.01％和24.80％.结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.     

人CD133基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建人干细胞标记分子CD133-2转基因细胞并探讨CD133-2分子的生物学功能。方法:利用分段克隆和重叠PCR方法从人胎肝cDNA文库中克隆出人CD133-2全长基因,经双酶切后装入真核表达载体p IRES2-EGFP中,用脂质体法转染L929细胞,加入G418选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法鉴定转基因细胞;MTT法分析转基因细胞对T细胞的体外增殖作用;流式细胞仪分析T细胞表面活化分子标记CD4CD25、CD8CD25的表达。结果:成功克隆和构建了能稳定表达人CD133-2分子的转基因细胞CD133-2/L929,该转基因细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖,下调T细胞表面分子CD4CD25和CD8CD25的表达。结论:稳定表达CD133-2蛋白的转基因细胞株的建立为该基因功能的后续研究奠定了物质基础。     

ICOS/GL50信号在T细胞依赖性体液免疫应答中的作用

研究ICOS/GL5 0信号在T细胞体外增殖、细胞因子分泌以及B细胞抗体分泌中的作用 ,进一步探讨该信号途径在机体体液免疫应答中的作用机制。采用3 H TdR检测GL5 0 L92 9转染细胞和特异性鼠抗人GL5 0单抗对T细胞体外增殖的作用 ;ELISA法检测GL5 0 L92 9转染细胞和抗人GL5 0单抗对T细胞分泌IL 2、IL 10以及ICOS L92 9转染细胞和特异性鼠抗人GL5 0单抗对PWM介导的B细胞分泌抗体的效应。结果提示GL5 0 L92 9转染细胞能够促进经抗CD3单抗活化的T细胞增值和分泌IL 10 ,而抗GL5 0单抗可以阻断这些效应。ICOS分子与B细胞上GL5 0分子的结合上调PWM介导的B细胞分泌抗体而抗GL5 0单抗则下调这一效应。这些表明 ,ICOS/GL5 0信号途径在机体T细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥着重要的调节作用     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。     

人B7-H3基因转染及其生物学功能的研究

B7 H3是新近发现的B7家族新成员。为探讨其体外生物学功能及单克隆抗体的研制构建了B7 H3基因转染细胞。利用PCR的方法扩增出B7 H3基因 ,继而插入逆转录病毒载体pGEZ Term ,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,经用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选获得B7 H3的基因转染细胞。RT PCR、Westernblot和流式细胞仪表型分析等方法鉴定表明 ,B7 H3/L92 9基因转染细胞能稳定表达人B7 H3蛋白。继而基因转染细胞对T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖。ELISA法分析表明该基因转染细胞抑制活化T细胞IFN γ及IL 10的分泌。CD2 8信号可以逆转B7 H3对活化T细胞的抑制效应。综上结果证实 ,B7 H3对体外活化的T细胞具有负性调控作用。     

Critical contribution of CD80 and CD86 to induction of anterior chamber-associated immune deviation

Intraocular inoculation of antigens induces anterior chamber-associated immune deviation (ACAID), which is mediated by development of regulatory T cells in response to antigen-presenting cells (APC) pre-conditioned by intraocular transforming growth factor-beta (TGF-beta). In this study, we examined the involvement of T-cell co-stimulatory molecules in this process. To mimic the intraocular APC, thioglycollate-elicited peritoneal exudate cells (PEC) were pre-treated with TGF-beta in vitro. Expression of CD80, CD86, OX40 ligand (OX40L) and CD70 was analyzed by flow cytometry. Contribution of these molecules to co-stimulatory activity of TGF-beta-treated PEC on antigen-stimulated T-cell proliferation and cytokine production was determined by inhibition with blocking antibodies in vitro. Contribution of CD80 and CD86 to induction of ACAID was determined by the administration of blocking antibodies at intraocular antigen inoculation in vivo. TGF-beta-treated PEC expressed CD80 and CD86 but not OX40L or CD70. Antigen-stimulated T cells proliferated and produced IL-10, but not IFN-gamma, in response to co-stimulation by TGF-beta-treated PEC, which was abrogated by blocking antibodies against CD80 and CD86. Induction of regulatory cells mediating ACAID was abolished by in vivo blockade of CD80 and CD86. The present results indicated that CD80 and CD86 play a critical role in induction of ACAID, possibly by co-stimulating expansion and IL-10 production of regulatory T cells in response to TGF-beta-conditioned APC.     

转人B7.2基因的L929细胞对T细胞增殖和分泌IL-10的作用

应用RT-PCR法,从由LPS刺激的人的DC细胞中抽提mRNA,扩增获得编码人B7.2分子的cDNA,并将其克隆到PMD18-T载体,经PCR、酶切及测序进行鉴定确证,进而构建PEGZ-term-B7.2的真核表达载体。脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的上清感染L929细胞,经Zeocin筛选,建立稳定表达人B7.2分子的L929基因转染细胞株。并证实了B7.2基因转染细胞能有效地促进T细胞的体外增殖和促进IL-10的分泌。