黄黑小斑蝥纤溶活性蛋白分离纯化及性质研究

目的以药用斑蝥(Mylabris)为原料,从其中分离纯化得到一种具有纤溶性的蛋白MFP(Fibrinolyric Protein of Myla-bris)。方法采用硫酸铵分段盐分、透析和DEAE-32纤维素离子交换层析等纯化方法进行分离纯化,SDS-PAGE电泳测定其分子量,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性。结果该目的蛋白相对分子质量约为95.5 kD,其水解纤维蛋白的相对比活力为14.7 u/mg;该成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+,Na+对其活力无影响,Mn2+,Ca2+对其有明显抑制作用,最适pH为6.0。结论研究分离出的斑蝥活性蛋白确为一种具有纤溶性的蛋白组分,并证明其纤溶作用机理为纤溶酶原激活;体外溶栓实验表明,其对血栓的溶解具有一定作用;溶血实验结果表明,该纤溶活性蛋白溶液无溶血反应。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定。结果表明：经纯化的蚯蚓溶酶其分子量在20KD－30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性。纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定.结果表明经纯化的蚯蚓纤溶酶其分子量在20KD-30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性.纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的.     

沙蚕纤溶酶的一种纯化方法

目的 从双齿围沙蚕体内提取并纯化一种新的纤溶酶。方法 应用硫酸铵沉淀、透析、凝胶柱层析（Sephadex G-100）以及电泳等生化手段对沙蚕纤溶酶进行分离纯化。用平板法测定它降解纤维蛋白的活性。结果 得到纯的沙蚕纤溶酶,测出其等电点为4．5左右,由两条边组成,其相对分子量分别为33000u和14400u。结论 该酶为首次从沙蚕中发现的一种新的纤溶酶。     

地鳖虫纤溶成分的分离纯化和活性测定

本文通过硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素柱和非变性PAGE制备电泳等方法从雌性地鳖虫EupolyphagesinensisW alker活体内分离纯化得到三种纤溶活性成分:EFF-1、EFF-2和EFF-3,分子量分别为41 kd、32.9 kd和30.6 kd,比活力分别为171.3 U/mgpr、234.0 U/mgpr和148.5 U/mgpr,其中EFF-2和EFF-3兼有纤溶酶激活物和纤溶酶活性。     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化，得到蚯蚓纤溶酶纯化样品，并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究，确定HPLC、SDS—PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法。同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序，获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料。     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化,得到蚯蚓纤溶酶纯化样品,并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究,确定HPLC、SDS-PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法.同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序,获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料.     

蚯蚓纤溶酶研究概述

对具有纤溶活性的物质研究已有多年的发展,但是血栓性疾病仍然是致人死亡或身体机能障碍的主要原因之一。从具有特殊生理功能的生物体中获取活性物质近来受到广泛关注,在蚯蚓消化腺的分泌物中纯化得到一组同工酶,表现出良好的溶栓效果,并被命名为蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）。本文在多层次上对蚯蚓纤溶酶作一综述,内容包括：蚯蚓纤溶酶的纯化、克隆表达,并详细介绍该酶结构与功能之间的关系以及临床应用等。     

山茱萸多糖的分离纯化及部分理化性质研究

目的:从山茱萸果实中分离出山茱萸多糖,并研究其理化性质。方法:新鲜山茱萸果实经热水浸泡后在碱性条件下提取、脱蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE-cellulose柱色谱分离,再经过SephacrylS-300凝胶柱色谱进一步纯化。结果:得到一种白色粉末状均一酸性多糖M。结论:多糖M包含2个单糖。     

永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究

目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂,并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料,经脱脂,酸性溶液提取,硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物,再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂,以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%~40%;用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4 d,发现其血糖值明显低于模型组;观察小鼠的胰组织病理切片,与糖尿病小鼠比较,灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论豆豉提取液有较明显的降糖作用。     

地龙的鲜品和干品可溶性蛋白及纤溶酶活性的对比研究

目的:对比研究地龙的鲜品和干品的可溶性蛋白及纤溶酶活性.方法:采用Bradfold方法测定蛋白含量,SDS-PAGE进行蛋白谱带的分析,并采用琼脂糖-纤维蛋白平板法进行纤溶酶活性的测定.结果:以干燥品计,鲜品的蛋白提取率为( 13.89±0.86)％,蛋白含量为(63.14±0.38)％,体外纤溶酶活性为(8 743 ±17) IU·g-1;干品蛋白提取率为(9.82±0.75)％,蛋白含量为(45.16 ±0.12)％,体外纤溶酶活性为(206±14) IU·g-1;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,鲜品共显示12条蛋白谱带,干品的谱带较少,且不清晰.结论:鲜地龙的可溶性蛋白提取率、含量及体外纤溶酶活性均明显高于干品,且蛋白组分有较大的差异.     

蚯蚓纤溶酶抗肝癌转移作用的实验研究

目的 探讨蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)对人肝癌细胞转移的影响.方法 建立裸鼠人肝癌高转移原位移植瘤模型,造模后7 d将裸鼠随机分为模型对照组和EFE高、低剂量组,共3组,每组7只,每天分别给予生理盐水和1600,800 uku/kg EFE灌胃,连续30 d.实验结束时完整剥除种植瘤并称重;肉眼直接观察种植瘤的肝内播散及腹腔种植情况,计算肝内播散率及腹腔种植率;通过病理切片观察肺转移肿瘤灶的数目;采用RT-PCR及Western blot方法检测移植瘤中FAK(focus adhesion kinase)及β1-整合素蛋白的表达.结果 与模型对照组相比,EFE低、高剂量组原位种植瘤瘤重减轻(P＜0.05或P＜0.01);种植瘤肝内播散率和腹腔种植率降低,其中,EFE高剂量组与模型对照组比较,具有显著性差异(P＜0.05);肺转移灶数目明显减少,与模型对照组相比,具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).在原位种植瘤和移植瘤中FAK及β1-整合素在mRNA及蛋白水平的表达方面,EFE高、低剂量组的表达均明显下降,与模型对照组比较具有非常显著性差异(P＜0.01).结论 EFE具有抗肝癌转移的作用,其机理可能与EFE能够抑制FAK及β1-整合素的表达有关.     

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×10³);重组pMAL-p2表达出51.0×10³的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。     

纳豆激酶分离纯化及其性质研究

目的：优化纳豆激酶分离纯化工艺，并研究其理化性质和酶学性质。方法：通过硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose F．F．柱层析、冷冻干燥得到纳豆激酶；SDS-PAGE测定纳豆激酶分子量；Lowry法测定蛋白质含量；纤维蛋白平板法测定其纤溶活性；并研究温度、pH、金属离子和抑制剂等因素对其纤溶活性的影响、结果：纳豆激酶的分子量约为28kD；在pH 5-12和温度不高于60℃范围内其活性稳定；K^ 、Ca^2 、Fe^3 、Md^2 、Mn^2 等金属离子对纳豆激酶活性无明显影响，而Cu^2 明显抑制其纤溶活性；ε-ACA和EDTA对纳豆激酶活性无明显影响，而100μmol／L的PMSF能完全抑制其活性；纳豆激酶的纤溶活性为蚓激酶的1．6倍。结论：建立纳豆激酶的分离纯化方法并鉴定了其部分性质。     

蚯蚓纤溶酶去糖基化和免疫反应性分析

 目的对去糖基化的蚯蚓纤溶酶进行免疫反应性分析。方法①将变性的蚯蚓纤溶酶全组分与免疫佐剂混合,免疫家兔制得抗血清,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和Western-blotting检测抗血清的效价。②三氟甲基磺酸去除蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的糖链,SDS-PAGE和ConA-HRP亲和印迹检测糖链的去除情况。③ELISA和Western-blotting检测糖链去除前后蚯蚓纤溶酶免疫反应性是否有变化。结果去除糖链后蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的免疫反应性基本没有变化。结论糖链的存在与否对蚯蚓纤溶酶组分免疫反应性的影响不大,提示蚯蚓纤溶酶分子上的寡糖链可能不构成其抗原决定簇。     

一种新型蚯蚓纤溶酶的研究

采用加提取剂的匀浆、盐析、超滤及层析方法从一种环毛蚓中获得一种新型纤溶酶。此酶分子量为22000,为单链蛋白。它不仅有强烈的直接溶解血栓及人纤维蛋白活性,而且还有纤溶酶原激活作用;动物试验表明此酶的毒副作用很小。本方法获得的酶的活性、纯度及得率都很高。     

发酵品醇提物吸入粉雾剂处方筛选及性质表征研究

目的:研究全蝎、白术、蛴螬混合发酵品(SAHHFP)醇提物的吸入粉雾剂处方筛选及性质表征。方法:将SAHHFP醇提物冻干粉与乳糖按1∶1、1∶2、1∶3、3∶4的比例混合得到的喷雾干燥粉制成胶囊型吸入粉雾剂,通过对粒径、电位、流动性、吸湿性和吸入粉雾剂空气动力学有效沉积率的比较,得到两者的最佳配比。结果:SAHHFP醇提物冻干粉与乳糖按1∶1比例混合得到的喷雾干燥粉流动性、吸湿性和有效沉积率均优于另外三个比例。结论:SAHHFP醇提物冻干粉与乳糖按1∶1比例混合得到的喷雾干燥粉可以制成胶囊型吸入粉雾剂,且具有较好的稳定性。     

蚯蚓溶栓酶对大鼠凝血及纤溶指标的影响

低剂量的溶栓酶用于大鼠能引起纤维蛋白原（Ｆｂｇ）平均下降４５％，凝血酶时间（ＴＴ）由１１．１３秒延长到２２．６３秒（Ｐ＜０．０１），而凝血酶原时间（ＰＴ）及白陶土部分凝血活酶时间（ＫＰＴＴ）无显著性变化（Ｐ＞０．０５）。但高剂量的溶栓酶除能明显降低Ｆｂｇ和延长ＴＴ外，而且可使ＰＴ由１６．８２秒延长到７３．４４秒及ＫＰＴＴ由４６．６３秒延长到１２４．１３秒，并能使Ⅱ、Ⅷ因子降解，起到强的抗凝效果