细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒HSP70/pGEM-T中酶切HSP70目的片段,亚克隆入表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.HSP70/pET-28a/E.coli BL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到14kDaEg.HSP70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

生物信息学技术在细粒棘球蚴热休克蛋白70重组疫苗研究中的应用

目的 通过基因序列分析,寻找细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)热休克蛋白基因(Heat shock pm-tein7,HSP70),为包虫病防治筛选新的候选疫苗抗原.方法 ①登录 GenBank 公共数据库,检索 EgHSP70目的基因序列.②对克隆基因进行测序,结果输入DNAStax、BioSun分析软件和互联网 SWISS-MODEI 数据库,对重组 EgHSP70 的特性、抗原表位及构象进行预测分析.结果 ①获得了具有完整开放阅读框的 EgHSP70核苷酸序列.②DNAStar分析软件推算氨基酸序列结果显示,EgHSP70由133个理论氨基酸组成,分子量约为14.53kDa.DNAStar、BioSun分析软件确定了重组 EgHSP70 可能的抗原表位.与其他动物热休克蛋白70氨基酸的同源性分析结果显示EgHSP70具有高度的保守性.结论 生物信息学技术在 EgHSP70 重组疫苗研究中有一定的理论和应用价值.     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组、表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组表达质粒ferdfin/pET-28a,表达、纯化出重组蛋白,并对重组蛋白的免疫学特性进行初步研究.方法 将目的 基因亚克隆至表达载体pET-28a,转化人大肠杆菌B121(DE3)plysS,加入IPTG对其进行诱导表达.通过Ni2的His-bind树脂柱纯化出重组蛋白,用50μg/100μL免疫ICR小鼠.获得抗血清,通过webern-blot及ELISA对重组铁蛋白的免疫学特性进行初步研究.结果 表达并纯化出分子量约19kD重组铁蛋白,western-blot显示重组蛋白免疫制备的抗血清可识别纯化的重组蛋白及抗原囊液、原头蚴,位置大致相同,约19kD.ELISA结果显示实验组小鼠与对照组小鼠血清中IgG的OD值有统计学意义(P＜0.01).结论 细粒棘球蚴重组铁蛋白Eg.ferritin具有较好的抗原性及免疫原性,具有成为包虫疫苗候选分子的潜能.     

细粒棘球蚴重组EgP-29诱导免疫小鼠脾细胞增殖及细胞因子水平的变化

目的 探讨细粒棘球蚴重组抗原(rEgP-29)接种小鼠后的免疫保护机制.方法 ICR小鼠随机分为免疫组和对照组,采用rEgP-29免疫、Eg原头蚴攻击感染小鼠后20周,以MTT法检测经刀豆蛋白(ConA)和rEgP-29刺激后T淋巴细胞增殖水平,ELISA法检测体外脾细胞诱生的IL-2、IL-4和IFN-γ水平.结果 MTT法检测证实rEgP-29免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平明显高于对照组(P＜0.05);ELISA法检测表明,免疫组小鼠经ConA或rEgP-29诱生的IL-2、IFN-γ水平与对照组相比显著增加(P＜0.05),而IL-4水平无明显变化.结论 rEgP-29可能诱导Th1型免疫应答为主,对抗Eg原头蚴攻击感染.     

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因(myophilin)的重组质粒进行原核表达、纯化,并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法对已构建的基因工程菌株myophilin/pGEM-T/JM109进行酶切,获取目的基因。将目的基因亚克隆于表达载体pET28a构建基因工程菌株,筛选阳性表达菌株并进行诱导表达、经SDS-PAGE鉴定重组myophilin蛋白。以纯化的myophilin做抗原免疫小鼠,用Western blot、ELISA对该蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平进行检测。结果成功构建含原核重组表达载体myophilin/PET28a/BL21,并纯化出浓度较高的重组蛋白;ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了一定水平的血清抗体;实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化后的重组蛋白myophilin具有较强的免疫原性,有望作为包虫病候选疫苗进一步研究。     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1抗原的免疫原性研究

目的对细粒棘球蚴重组抗原EF-1的免疫原性进行初步鉴定,为重组疫苗研制的后续工作提供依据.方法用重组目的蛋白及融合表达蛋白作为抗原,分别免疫昆明小鼠获得抗血清,通过蛋白免疫印迹试验（Western blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中产生的特异性抗体成分及其程度.结果重组目的蛋白EF-1和融合蛋白GST/EF-1免疫小鼠后均诱发产生了特异性抗体,实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义（P＜0.05）;目的蛋白和融合蛋白免疫两组小鼠所得血清的抗体含量差异没有统计学意义.结论目的蛋白EF-1和融合蛋白GST/EF-1都具有一定的免疫原性.     

细粒棘球蚴细胞系培育及其免疫研究

从细粒棘球蚴病人体内获取生发层和原头节作为培养材料,采用改良DMEM培养液和胶原蛋白包被的培养瓶进行细胞培养,建立了适合人源细胞棘球蚴细胞体外培养的方法,并探讨棘球蚴细胞培养的刺约因素。首次成功培育出一株人源细粒棘球蚴细胞系（13G－5）,至1997年3月1日为止该细胞系已培养了140d,其间传了21代。该细胞系主要以成纤维型细胞为主,呈贴壁生长;用该细胞系细胞接种于昆明（km)小鼠胜利腹腔内,能形成具包囊样结构的类似包裹;接种鼠产生对囊液抗原的特异性抗体;ELISA能够检测出细胞代谢物中特异性抗原;该细胞系细胞和E.granulosus原头节、包裹液具有相同的EST酶带;使用该细胞系细胞的代谢物作为粗制抗原进行免疫预防接种,能使60％的Km小鼠获得安全抵抗E.granulosus感染的能力,该抗原能使43．33％－77．42％的包虫病诊断出来。此外,检定了人源细胞粒棘球蚴染色体,染色体数为14－18条,并首次对其进行了G－、C－带分析。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆抗原和分泌抗原２ｍｌ，加完全佐剂和不完全佐剂，免疫犬２次，每次间隔２１天，可使犬获得不完全抗攻击感染的能力。匀浆抗原的免疫优于分泌抗原，感染率为２５％，与对照组９０％比有显著差异，并对体现人虫体的发育有明显抑制作用，孕卵率为０；分泌抗原的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大，经抗原蛋白组份分析，原头匀浆抗原显示１４条蛋白组份，分别为２２．５、３１．０、３６．０、４０．０     

细粒棘球蚴中国大陆株重组14-3-3蛋白基因的克隆和序列分析

目的对细粒棘球蚴中国大陆株14-3-3蛋白（E.g-14-3-3Pc）基因进行克隆及序列分析,为进一步重组抗原的表达奠定基础.方法根据互联网GeneBank中检索到的E.g-14-3-3Pc序列设计一对PCR引物,用RT-PCR方法以细粒棘球蚴总RNA为模板扩增出目的DNA片段,并克隆于载体pGEM-T,测定其核苷酸序列.结果成功克隆出E.g-14-3-3Pc基因片段,测序证明克隆基因确为E.g-14-3-3Pc.结论成功构建细粒棘球蚴pGEM-E.g14-3-3菌株.     

肝细粒棘球蚴病的CT诊断

本文报道67例肝细粒棘球蚴病的CT表现,其中包括单房性包虫囊肿32例、多房性包虫囊肿35例。囊肿有钙化42例,并发破裂/感染34例。作者认为本病最主要的CT表现为肝内有边缘光滑、密度均匀的圆形或卵圆形阴影,CT值近于水。囊壁的显示及其钙化、子囊的存在,囊膜剥离征则具有特征性,可作为CT诊断本病的重要依据。作者探讨了本病CT表现的病理基础,并提出与肝囊肿、肝脓肿、坏死性或囊性肝转移瘤以及少见的肝内胆管癌和特殊的肝癌的鉴别。     

枸杞多糖对细粒棘球蚴小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的研究枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBPs)对细粒棘球蚴小鼠脾脏T细胞亚群的影响,初步探讨LBP对细粒棘球蚴感染后机体免疫功能变化的影响。方法枸杞多糖溶液皮下给药3次,每次间隔2周,于第3次给药后2周,用细粒棘球蚴原头蚴攻击感染BALB/c小鼠,使用流式细胞仪动态检测给药前后、感染前后不同时间点小鼠脾脏IFN-γ+CD3+T细胞、IL-4+CD3+T细胞占总T细胞的比例以及CD4+/CD8+T细胞的比值变化。结果与给药前比较,枸杞多糖给药后7周,小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加,分泌IL-4的T细胞比例减少,CD4+/CD8+的比例明显增加;与感染对照组相比,枸杞多糖能使细粒棘球蚴感染小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加(感染后2、15周);分泌IL-4的T细胞比例减少(感染后2、10周),CD4+/CD8+的比例先升高(2、10周),后降低(15、20周)。结论枸杞多糖有正向免疫调节作用,通过促进细粒棘球蚴感染小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1的分化,抑制Th2的分化,发挥抗细粒棘球蚴的作用。     

肝包虫囊肿的磁共振诊断

对１０例经手术证实的肝包虫囊肿（又称细粒棘球蚴病）的磁共振成像（ＭＲＩ）进行分析，认为其特征性表现为：囊壁呈光滑厚薄均一的低信号的包膜，在Ｔ２加权像上显示更加清楚；母囊内有数个大小不等的子囊，整个病灶呈多房性似玫瑰花状。本文对肝包虫囊肿与肝内其它囊性占位病变的鉴别诊断进行了探讨。     

热休克蛋白70在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义

目的:观察热休克蛋白70(HSP70)在人骨肉瘤组织中的表达。方法:采用免疫组化SP法检测55例骨肉瘤组织,其中骨母细胞型24例,软骨母细胞型20例,纤维母细胞型11例,以及30例正常骨组织中HSP70的表达情况。结果:HSP70在正常骨组织与骨肉瘤组织中的表达率分别为20%(6/30)及96.4%(53/55),平均阳性细胞率分别为0.53%和95.57%,两者差异具有统计学意义(P<0.01),在骨母细胞型、软骨母细胞型与纤维母细胞型中阳性表达率分别为98.65%,92.37%,90.36%,三者之间差异无统计学意义。HSP70在骨肉瘤中的表达与病理分级有明显相关性(P<0.05),与临床分期无关(P>0.05)。结论:HSP70在人骨肉瘤组织中高表达,可作为判断恶性程度的重要指标以及肿瘤免疫的重要靶位。     

大鼠角膜创伤愈合过程中HSP70表达的实验研究

目的 观察大鼠角膜创伤愈合过程中热休克蛋白70（HSP70）的表达规律,探讨其在创伤愈合中的作用.方法 雌性Wistar大鼠42只,随机分为7组,每组6只,其中,正常对照组6只,动物模型组36只.均取右眼制作角膜针刺损伤模型,于损伤后各时间点（6h,1d,3d,5d,7d,14d）取角膜标本,HE染色行组织病理学检查,免疫组化染色观察HSP70在大鼠角膜的表达与分布,用计算机图像系统对结果进行分析.结果 HSP70在大鼠正常角膜各层均有表达,动物模型组大鼠角膜上皮HSP70的表达水平于损伤后第1天显著增高（P〈0.05）,其后逐渐下降,至损伤后第14天时恢复正常.角膜基质层和内皮层HSP70的表达在各时间点未见明显变化.结论 HSP70在大鼠角膜创伤愈合过程中的早期表达水平明显增高,其可能是参与调节角膜创伤愈合的一种重要分子.     

细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）铁蛋白（ferritin）基因序列,进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴铁蛋白基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,待PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,测序表明该基因为562bp。同源性比较结果表明：该基因序列与已发表基因核苷酸序列相比,390bp同源性约为97.7％,推导编码氨基酸序列同源性为97.7％,此基因序列在435bp出现终止密码。结论 测序的铁蛋白基因序列有完整的编码框,为进一步研究其结构和功能,以及对包虫病的免疫预防具有重要意义。